I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell
Summary
Målet med denne protokollen er å tillate oppdaging av in vivo antigen-spesifikke drepe en Målcelle i murine modell.
Abstract
Gjeldende metoder for antigen-spesifikke drap er begrenset til i vitro bruk eller benyttet i infeksjonssykdommer modeller. Det er imidlertid ikke en protokoll spesielt ment å måle antigen-spesifikke drepe uten en infeksjon. Denne protokollen er utformet og beskriver metoder for å overvinne disse begrensningene ved å tillate for påvisning av antigen-spesifikke drepe for en Målcelle ved CD8+ T celler i vivo. Dette oppnås ved å flette en vaksinasjon modell med en tradisjonell CFSE-merket målet drepe analysen. Denne kombinasjon gjør forskeren å vurdere antigen-spesifikke CTL potensialet raskt og direkte som analysen ikke er avhengig av tumor vekst eller infeksjon. I tillegg er avlesning er basert på flowcytometri og så skal være lett tilgjengelig for de fleste forskere. Stor begrensning av studien er å identifisere de tidslinjen i vivo som passer hypotesen blir testet. Variasjoner i antigen styrke og mutasjoner i de T-cellene som kan resultere i differensial cytolytic funksjonen må vurderes nøye for å finne det optimale tidspunktet for cellen høsting og vurdering. Aktuelle konsentrasjonen av peptid for vaksinasjon er optimalisert for hgp10025-33 og OVA257-264, men ytterligere validering ville være nødvendig for andre peptider som kan være mer passende til en gitt studie. Samlet denne protokollen tillater en rask vurdering av drap funksjon i vivo og kan tilpasses alle gitt antigen.
Introduction
Flere protokoller finnes for å vurdere cytolytic (CTL) potensialet i en CD8+ eller CD4+ T-celle. Denne vurderingen kan lett gjort i vitro under kontrollerte forhold1,2,3. I tillegg infeksjonssykdommer modeller, for eksempel LCMV, klassisk har undersøkt CTL-funksjonen ved hjelp av ulikt CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) merket målcellene hvor den CFSEHei-merkede celler pulserende peptid og CFSElo-merket målet celler igjen unpulsed. Cellene deretter injisert på en 1:1 ratio og vurdert for tap av den CFSEHei-merket pulserende mål av flyt cytometri4. Vaksine og avvisning modeller har også brukt lignende strategier for vurdering av i vivo drepe av både CD8+ og CD4+ T celler samt NK celler5,6. Dette er en kraftig analysen, men krever bruk av smittestoffer som prime immunsystemet før målet injeksjon.
Denne protokollen, derimot, krever ingen tidligere smitte av verten og utnytter stedet en vaksinasjon strategi for å prime immunsystemet før målet injeksjon. Denne vaksinasjon består av en vannbasert formulering av peptid vaksine som krever levering av en immunostimulatory cocktail kalt covax7, bestående av en Toll-like reseptor 7 (TLR7) Agonistiske (imiquimod krem), en agonistic anti-CD40 antistoff, og interleukin-2 (IL-2) fører til synergistisk kombinasjon av immunostimulatory agenter for elicitation av peptid-spesifikke grunning og robust immunrespons. Som gir denne analysen en rask avlesning CTL-funksjonen som vaksinen administreres med cellene for vurdering av funksjonen bare tre dager før injeksjon av målcellene. I tillegg er covax grunning sterk nok til at drapet kapasitet primet antigen-spesifikke T cellen kan sees mellom 4 og 24 h etter injeksjon.
Stor begrensning av denne protokollen er å identifisere den tidslinje i vivo for deteksjon av mål drapet som passer både antigen og hypotesen blir testet. Forsiktig vurdering må utføres, som variasjoner i antigen styrke samt genetiske endringer blir testet i T-celler kan føre differensial CTL-funksjon som krever forskjellige timing gjenkjenning av målet drapet. Dessuten, mens den aktuelle konsentrasjonen av peptid for vaksinasjon er optimalisert for menneskelig melanom antigen glycopeptide 100 (hgp10025-33) og ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , bruk av en annen antigen modell som kan være mer passende til en gitt studie vil kreve ytterligere validering. På grunn av forventet forskjeller i et mål antigener evne til å stimulere CTL effektor funksjon i kombinasjon med covax som en adjuvans, kan optimalisering av IL-2 dose konsentrasjon og dose frekvens være avgjørende for å oppnå det ønskede mål. Samlet denne protokollen gir en rask vurdering av drap funksjon i vivo og kan tilpasses alle gitt antigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er ukomplisert, er det noen viktige trinn som må utføres nøye. Covax grunning etter injeksjon av antigen-spesifikke T-celle testes er nødvendig å se noen drapet på de pulserende mål. Det er mulig at vannbasert covax vaksinasjon skaper en akutt betennelsestilstand, for kronisk inflammatorisk fase, kan erstatte kortvarig vannbasert formulering med en langsom antigen utgivelsen olje-basert tilnærming gi en bedre utfallet7,12.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av NIH forskning (A1R03AI120027 (RN) og 1R21AI20012 (RN)), institusjonelle Research Grant (RN), oppstart gi (RN) og MD Anderson CIC frø gi (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
