Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Summary

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato – encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Abstract

O objectivo do presente protocolo apresenta um procedimento otimizado para purificação e cultivo de pBECs e para estabelecer em vitro barreira hemato – encefálica (BBB) modelos baseados em pBECs em mono-cultura (MC), MC com astrocyte-condicionado médio (ACM), e sem contato co-cultura (NCC) com astrócitos de suínos ou rato origem. pBECs foram isoladas e cultivadas de fragmentos de capilares dos córtices cerebral de suínos domésticos 5-6 meses de idade. Esses fragmentos foram purificados por remoção cuidadosa de meninges, isolamento e homogeneização da massa cinzenta, filtração, centrifugação e digestão enzimática. Para eliminar mais células contaminantes, os fragmentos capilares foram cultivados com puromicina contendo médio. Quando 60-95% de confluencia, pBECs crescente dos fragmentos capilares foram passadas para filtro de membrana permeável insere e estabelecidos nos modelos. Para aumentar a tensão de barreira e fenótipo característico de BBB de pBECs, as células foram tratadas com os seguintes factores de diferenciação: permeant 8-CPT-acampamento da membrana (acampamento abreviado aqui), hidrocortisona e um inibidor da fosfodiesterase, 1724-RO-20 (RO). O procedimento foi realizado durante um período de 9 a 11 dias, e ao estabelecer o modelo do NCC, os astrócitos foram cultivados 2-8 semanas de antecedência. Aderência aos procedimentos descritos no protocolo permitiu a criação de camadas endoteliais com permeabilidade restrita paracellular, com o NCC modelo mostrando uma resistência elétrica média transendothelial (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω ²e paracellular permeabilidade (P._app) para Lúcifer amarelo de 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm s^-1 (quer dizer SEM ±, n = 55). Nova avaliação deste fenótipo pBEC mostrou boa expressão da proteínas juncionais apertado claudin 5, ZO-1, occludin e adherens junção catenina p120 de proteína. O modelo apresentado pode ser usado para uma variedade de estudos do BBB na saúde e na doença, e, com a permeabilidade de paracellular altamente restritiva, este modelo é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular.

Introduction

A estrutura celular e função da barreira sangue – cérebro

Na interface do sistema nervoso central e circulatório (CNS), o BBB atua como um site chave reguladora para controle homeostáticos do microambiente do CNS, que é essencial para o bom funcionamento e proteção do sistema nervoso. O site do BBB é as células endoteliais que revestem o lúmen do vaso sanguíneo. Nos capilares do cérebro, as células endoteliais formam complexas intercelulares junções apertadas e testes padrões da expressão fortemente polarizada de transportadores de influxo e efluxo particulares assegurar transporte molecular altamente específica entre o sangue e o cérebro ¹. Os componentes estruturais dos complexos junção apertada incluem proteínas da família occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin e associado a moléculas de adesão (compotas). Claudin 5 é particularmente importante na restrição paracellular juncional. Indução e manutenção deste fenótipo endotelial do BBB característico envolvem interações dinâmicas com células circundantes, incluindo pericitos, astrócitos, neurônios e as membranas do porão, que, juntamente com o cérebro endotelial, células de forma a neurovascular unidade (NVU)^2,3. Os mecanismos envolvidos nessas interações não são compreendidos ainda inteiramente, mas incluem a troca de sinais químicos entre as células, que permite a modulação da permeabilidade do BBB a curto prazo e induz a longo prazo BBB características⁴. Astrócitos, especialmente, são conhecidos por contribuir para o fenótipo de células endoteliais do cérebro e são uma fonte de fatores regulatórios como gliais-derivado neurotrophic factor (afetando cAMP intracelular)⁵, de fator de crescimento fibroblástico básico⁶, Hidrocortisona⁷e transformadora fator de crescimento β (TGF-β)⁸. O efeito de TGF-β, no entanto, tem sido debatida⁹.

In Vivo em Vitro BBB

Estudos in vivo continuam a fornecer informações valiosas sobre a biologia do BBB. No entanto, modelos de cultura celular podem fornecer insights adicionais e constituem ferramentas úteis para a compreensão de aspectos moleculares e funcionais detalhados do BBB na saúde e na doença. Embora as interações complexas entre os tipos de células e constituintes do BBB são difíceis de alcançar plenamente em modelos em vitro , tem havido, desde a primeira purificação de células endoteliais do cérebro e aplicação destes em mono-culturas ^{10 , 11 , 12}, o desenvolvimento extensivo dos processos de purificação e condições de crescimento do BBB celulares modelos de cultura, resultando em maior semelhança com a barreira na vivo . Os modelos usados em vitro BBB baseiam-se em células primárias de roedor, suínos e bovina de origem e em linhas celulares imortalizado. Cada modelo tem diferentes vantagens e desvantagens. Para a escolha do modelo e comparação, marcadores de validação como expressão de enzimas, transportadores, receptores e proteínas estruturais BBB são usados para criar visões gerais do atual estabelecido modelos¹.

O protocolo

Uma característica importante do BBB é tensão de barreira e TEER alta, ainda um grande número de modelos disponíveis não refletem bem os níveis na vivo . Incorporando contribuições de desenvolvimento e otimização de vários laboratórios, o objectivo do presente protocolo é apresentar um método para estabelecer um alta TEER em vitro BBB modelo baseado na pBECs primária no MC com ou sem ACM, ou no NCC com primário astrócitos de ratos ou de origem porcina. Os procedimentos aplicados e o estabelecimento do modelo incluem esforços para eliminar as células contaminantes e melhorar a diferenciação de pBECs em um fenótipo BBB. Este trabalho resultou na criação de modelos TEER confiáveis e de alta com paracellular baixa permeabilidade e boa expressão funcional de proteínas juncionais apertadas chaves, transportadores e receptores. No entanto, como os astrócitos são um fator contribuinte para o fenótipo de células endoteliais do cérebro, as três condições diferentes da cultura representam três diferentes fenótipos das células endoteliais do cérebro. O modelo NCC é especificamente útil para estudos de determinados mecanismos especializados envolvidos na descoberta de medicamentos, estudos de transporte e o tráfico intracelular, bem como para a investigação das interações célula-célula, onde é a máxima expressão de características BBB vantajoso.

Origem e história do protocolo

O modelo de pBEC descrito aqui baseia-se em grande parte no modelo porcino desenvolvido nos laboratórios Eisai (Londres) por Dr. Louise Morgan e seus colegas, que é baseado em um sucesso anterior cérebro bovino endothelial da pilha modelo¹³. O método original de preparação da pilha foi um dois-fase de filtragem usando nylon malhas para pegar o microvessels, seguido por uma etapa de subculturing para melhorar a pureza. No desenvolvimento do método anterior, tensão do fenótipo e barreira BBB ideal foram atingidos pelo crescimento médio e completados, incluindo ACM. Modificações adicionais para o método foram feitas por R. Skinner no laboratório do Prof N. Rothwell em Manchester UK^14,15. O método foi adotado pelo laboratório Abbott, KCL de Londres, onde Patabendige fez significativamente mais simples de preparar, evitando o uso de astrócitos ou ACM e eliminando células contaminantes como pericitos com puromicina. Os primeiros artigos confirmou que o modelo MC preservadas várias características importantes do na vivo BBB, incluindo junções apertadas eficazes, sistemas de transporte de membrana e mediada transcytosis^{16,17 , 18 , 19 , 20}. mais tarde S. Yusof novamente testado co-cultura astrocyte e melhorou significativamente TEER, então esta é a variante preferencial usado atualmente na Abbott laboratório²¹. O modelo agora tem sido com sucesso transferido para o M. Nielsen laboratório em Aarhus, onde novas modificações foram introduzidas (este protocolo), incluindo simplificadora cinza importa extração, usando malha apenas uma etapa de filtração e uma etapa de revestimento de filtro único combinação de colágeno e fibronectina. O procedimento aplicado para isolamento de suínos astrócitos (este protocolo) foi baseado em protocolos desenvolvidos pelo laboratório T. Moos em Aalborg, descrito por Thomsen et al.²². A TEER e outras propriedades do modelo gerado em Londres e Aarhus são semelhantes, que empresta a confiança para a noção de que o modelo é facilmente transferido entre laboratórios e responde bem a observação cuidadosa e racionalização das etapas do método. Com efeito, S. Yusof criou o modelo MC em um país tropical (Malásia)²³, que envolveu a nova adaptação para as condições locais e fontes de tecido.

Vantagens sobre métodos alternativos e atualmente estabeleceram modelos

Em comparação com células endoteliais do cérebro de origem bovina e roedor, pBECs oferecem a vantagem de ter uma menor taxa de perda do fenótipo BBB na vivo após isolamento²⁴. Além disso, os pBECs são capazes de formar barreiras endoteliais relativamente apertadas, mesmo quando cultivadas em MC (Ω 800 cm²)¹⁶ , em comparação com os níveis comumente relatados por monocamadas de linhas celulares, tais como bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm²) ^{25 , 26 , 27}, cEND (300-800 Ω cm²)^28,29,30e cerebEND (500 Ω cm²)^29,31,32e cerebrais primários células endoteliais de rato (100-300 Ω cm²)SS = “xref” > 33^,34,35,36 e rato (100-300 Ω cm²)^37,38. No entanto, a TEER demonstrou dependência sobre os procedimentos de purificação e de cultura. Na maioria dos casos, a adição de ACM ou co-cultura com astrócitos mostra diferenciação efeitos sobre as células endoteliais e um aumento na tensão das camadas endoteliais¹. No entanto, com os esforços para otimizar as condições de cultivo, apenas os modelos baseados em bovinos mostraram valores TEER comparável aos modelos baseados em suínos (médias de 800 Ω cm² no MC, até 2500 Ω cm² em co-cultura astrocyte)^{13 ,39,40,41,42,},^43,44,45. Como os modelos baseados no cérebro bovino primário, células endoteliais mostraram grandes variações, tanto entre como dentro de laboratórios^14,,^45,46,,^47,48, reprodutibilidade pode ser um problema. No modelo de pBEC relatado aqui, os laboratórios contribuindo alcançaram TEER muito semelhante e valores de permeabilidade paracellular com baixa variabilidade, tanto em e entre laboratórios. Daí, é possível que outros laboratórios estabelecer um modelo robusto com baixa variabilidade, usando o método apresentado aqui. Além de formar camadas endoteliais apertadas, modelos com pBECs anteriormente foram validados pela expressão de proteínas de junção apertada, transportadores BBB funcionais, receptores e enzimas e aptidão demonstrada para uma gama de estudos^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. Além disso, dados de transcriptoma inéditos sobre as culturas co de pBECs mostram um perfil esperado do BBB transportadores e receptores (resultados não publicados, Nielsen et al).

O modelo baseado em suínos de BBB tem uma vantagem adicional como o genoma, anatomia, fisiologia, e progressão da doença do porco refletem a biologia humana para um grau mais elevado do que outros modelos estabelecidos dispõe de⁶⁰, que são favoráveis para o indústria farmacêutica. Como cérebros de suínos são um subproduto comum da indústria da carne, eles constituem uma fonte facilmente acessível de cérebro células endoteliais, minimizando o número de animais necessários para as experiências e fornecendo um rendimento elevado da purificação de um cérebro de suínos. Apesar de purificação e cultivo de células primárias é um pouco demorados e exige conhecimentos especializados de normalização na criação do modelo, as células primárias gerar os modelos BBB mais confiáveis. Linha celular imortalizado não pode ser um substituto, como propriedades importantes, tais como tensão de barreira, perfis de expressão do transportador e regulamento do microambiente não refletem os resultados experimentais na vivo^{61, 62}. em vitro modelos oferecem a vantagem de viver-pilha de imagens com maior resolução, possibilitando a visualização de processos intracelulares, permitindo uma abordagem de proximidade para as células da amostra ou observadas, com objectivos com ampliação maior e melhor qualidade óptica⁶³. Isto não é o caso para o uso da microscopia de dois fotões em animais vivos. Além disso, em vitro modelos fornecem a capacidade de transfect células, permitindo a visualização de proteínas etiquetadas e investigação do seu tráfico.

Aplicações do modelo

A função do BBB não é fixo e pode ser modulada dinamicamente na fisiologia e patologia. Em muitas doenças neurológicas, incluindo neurodegenerativas, doenças inflamatórias e infecciosas, interrupções e aumento da permeabilidade do BBB é observado^64,,^65,66,67 . Para reduzir e prevenir a progressão da doença e danos subsequentes, identificação e caracterização dos mecanismos moleculares subjacentes à modulação do BBB são de grande importância. Neste contexto, confiável em vitro modelos estão em alta demanda pela indústria farmacêutica, em Além disso desempenham papéis importantes na previsão de permeabilidade BBB de drogas ao SNC. Qualquer modelo in vitro , servindo como uma tela de permeabilidade deve exibir um caminho paracellular restritiva, uma arquitetura cell fisiologicamente realistas e expressão funcional de mecanismos de transporte⁶⁸. Demonstrado em estudos anteriores^16,17,57e por paracellular permeabilidade e expressão de proteínas TJ e AJ aqui, o modelo apresentado atende a todos esses critérios e é adequado para uma variedade de BBB estudos em ambos fisiologia normal e em patologia. Os pontos fortes do método de purificação e cultivo apresentado incluem uma combinação de simplicidade e reprodutibilidade e a capacidade de incluir hamartomas influenciaram com um robusto e fiável alta TEER em vitro BBB modelo resultante. Para esta finalidade, astrócitos de suínos e rato origem têm sido mostrados para aumentar o fenótipo BBB de pBECs em um similar de maneira²².

Protocol

suínos cérebros foram obtidos como subprodutos da indústria alimentar dinamarquês. Matadouros dinamarqueses estão sob estrita supervisão e observação pelo dinamarquês Ministério do meio ambiente e alimentos. usados para a isolação de astrócitos de ratos foram criados e alojados em grupo na instalação de animais local a uma temperatura ambiente de 22 ° C – 23 ° C e em um ciclo claro/escuro de 12/12 h sob a inspeção do veterinário e de acordo com o dinamarquês regulamentos…

Representative Results

Estabelecimento dos modelos In Vitro de BBB No método apresentado, otimizado, a cultivo de pBECs e o estabelecimento do sistema de inserção de membrana permeável com MC ou sem ACM ou NCC com astrócitos (Figura 1) foi realizadas por um período de 9-11 dias (Figura 2). Para a seleção das células endoteliais, uma cultura inicial de fragmentos capilares purif…

Discussion

Purificação e proliferação de pBEC

Durante o processo de purificação, passos críticos incluem remoção rápida e eficaz das meninges e separação da matéria branca e cinza, que é importante para o rendimento de purificação e a pureza e para o estabelecimento adequado do modelo. Para o apresentado em vitro BBB modelo usando pBECs, nós temos melhorado e simplificado de um processo de purificação, com base na homogeneização mecânica de matéria cinzenta isolada, tamanho-s…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc