G2-seq: En High Throughput sekventering-baseret teknik til identifikation af sent replikerende regioner i genomet
Summary
Vi beskriver en teknik til at kombinere flowcytometri og høj overførselshastighed sekvensering til at identificere sent replicerer regioner i genomet.
Abstract
Mange teknikker har udviklet til at følge udviklingen i DNA-replikation gennem S fase af cellecyklus. De fleste af disse teknikker har været rettet mod udredning af placeringen og tidspunktet for indledningen af genome dobbeltarbejde snarere end dens afslutning. Det er imidlertid afgørende, at vi forstår regioner i genomet, der sidst at fuldføre replikering, fordi disse regioner lider forhøjede niveauer af kromosomale brud og mutation, og de har været forbundet med både sygdom og ældning. Her beskriver vi, hvordan vi har udvidet en teknik, der er blevet brugt til at overvåge replikering indledning i stedet identificerer områder af genomet sidst på komplet replikering. Denne tilgang er baseret på en kombination af flowcytometri og høj overførselshastighed sekventering. Selv om denne betænkning fokuserer på anvendelse af denne teknik på gær, kan tilgangen bruges med alle celler, der kan sorteres i en flow forskellige efter DNA indhold.
Introduction
Eukaryote genom replikering er indledt på flere diskrete websteder, kaldet oprindelsen af replikering, fra hvilke replikering gafler gå i begge retninger (gennemgik i Fragkos et al., 20151). Oprindelse varierer i både deres timing og effektivitet af fyring, og flere teknikker er blevet udviklet for at overvåge replikering oprindelse aktivitet og belyse årsagerne til denne variation. Aktiviteten af enkelte oprindelse kan udledes af niveauer af enkeltstrenget DNA2, der udgør omkring aktive oprindelse, eller ved hjælp af 2D gelelektroforese for at overvåge specifikke replikering mellemprodukter3, som begge kan opdages med radioaktive sonder. Begge af disse teknikker anvendes lettere i S. cerevisiae end i pattedyrceller, fordi oprindelse er begrænset til specifikke kendte sekvenser i den tidligere. Med fremkomsten af microarrays blev det muligt at vurdere oprindelse fyring globalt. Dette blev først gjort ved mærkning DNA med tunge isotoper, frigiver celler fra en G1 blok i medium indeholdende lys isotoper og derefter overvåge dannelsen af tunge-lette hybrid DNA på tværs af genom4. Indførelsen af høj overførselshastighed sekventering tilladelse lignende genome-wide overvågning af oprindelse aktivitet uden behov for dyre isotopiske mærkning. Celler blev sorteret i en flow forskellige efter DNA indhold og deres DNA underkastes dyb sekvensering. Fordi sekvens dækning provenuet fra 1 x til 2 x i løbet af S fase, kan relative replikering timing vurderes ved at sammenligne Læs dybder af celler i S fase til dem i G1 eller G25,6. Disse teknikker, især anvendt på gær, førte til en dybere forståelse af hvordan DNA-sekvens, kromatin struktur og DNA replikation proteiner regulere oprindelse timing og effektivitet.
Trofaste overførsel af genetiske oplysninger under cellulære spredning kræver ikke kun succesfuld indledning af DNA-replikation, som finder sted på oprindelse, men også fuldførelse af replikering, som opstår, hvor replikering gafler mødes. Som indledning af replikering varierer tidsplanen for færdiggørelsen af replikering på tværs af genomet med visse regioner, der fortsat unreplicated selv sent i cellecyklus. Sådanne regioner kan være særligt fjernt fra aktiv replikering oprindelse eller kan indeholde sekvenser eller kromatin strukturer, der hæmmer DNA polymeraser. Sent replikerende regioner kan manifestere sig som skrøbelige websteder, der er forbundet med kromosomale brud og højere mutation priser, og har været impliceret i kræft og aldring7,8,9. Trods vigtigheden af korrekt færdiggørelse af DNA-replikation i vedligeholdelse af genom stabilitet, har vores forståelse af hvor og hvordan dette foregår haltet langt bagefter replikering indledning. Og mens de enkelte gener hvis afdøde replikering har været forbundet med sygdom er blevet undersøgt med, for eksempel, qPCR10, globale undersøgelser rettet mod belyse steder og bagvedliggende årsager for sent replikering har manglet. Her beskriver vi en teknik, vi refererer til som “G2 seq”, hvor vi kombinerer flowcytometri med high throughput sekvensering til at kaste lys på færdiggørelsen af genom replikering i gær11. Med mindre ændringer, kan denne protokol tilpasses til eventuelle celler, der kan være flow-sorteret efter DNA indhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens denne teknik er robust og relativt ligetil, bør være genstand for særlig opmærksomhed følgende:
(1) vi anbefaler, at kulturer vokse i mindst 12 timer, før de når log fase, da forskellene åbenbart i cellecyklus distributioner hvis kulturer er hoestet efter at have nået den ønskede tæthed bare 4 h efter podning. Vores antagelse er, at en celle cyklus distribution, der har nået en relativt stabil ligevægt bedre repræsenterer en “rigtig” log fase distribution end en fordeling, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH GM117446 til A.B.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
