G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms
Summary
Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.
Abstract
Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.
Introduction
Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 20151) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA2, welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Zwischenprodukte3zu überwachen, können beide mit erkannt werden radioaktiven Sonden. Beide Techniken sind leichter in S. Cerevisiae als in Säugerzellen, angewendet, da Ursprünge auf bestimmten bekannten Sequenzen in der ehemaligen beschränkt sind. Mit dem Aufkommen von Microarrays wurde es möglich, die Herkunft weltweit brennen zu beurteilen. Dies geschah zunächst durch Kennzeichnung DNA mit schweren Isotopen, Freisetzung von Zellen aus einem G1 in mittlerer mit leichten Isotope und dann die Bildung von schwer-leicht-Hybrid DNA in das Genom4Überwachung. Die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung erlaubt ähnliche genomweite Überwachung der Herkunft Aktivität ohne das Erfordernis einer teuren Isotopen Kennzeichnung. Zellen wurden in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt und ihre DNA ausgesetzt Tiefe Sequenzierung sortiert. Da Sequenz Abdeckung von 1 X bis 2 X im Laufe der S-Phase verläuft, kann relative Replikation Timing durch Vergleich lesen Sie Tiefen der Zellen in der S-Phase, die in G1 oder G25,6bewertet werden. Diese Techniken, vor allem Hefe, führte zu einem tieferen Verständnis der wie DNA-Sequenz, Chromatinstruktur und DNA-Replikation Proteine Herkunft Timing und Effizienz regulieren.
Treue Übertragung der genetischen Information während der Zellproliferation erfordert nicht nur erfolgreiche Initiation der DNA-Replikation, die stattfindet am Ursprung, sondern auch erfolgreichen Abschluss der Replikation, die auftritt, wo Replikations-Gabeln treffen. Wie die Initiation der Replikation variiert der Zeitpunkt der Fertigstellung der Replikation des Genoms mit bestimmten Regionen bleiben bis spät in den Zellzyklus Langzeittransaktionen. Solche Regionen enthalten Sequenzen oder Chromatin Strukturen, die DNA-Polymerasen behindern oder möglicherweise besonders aktive Replikation Ursprünge fern. Spät repliziert Regionen kann als fragile Sites, manifestieren sich die chromosomalen Bruch und höhere Mutationsraten zugeordnet sind, und haben bei Krebs und Altern7,8,9in Verbindung gebracht. Allerdings hat unser Verständnis von wo und wie dies geschieht trotz der Bedeutung der ordnungsgemäßen Abschluss der DNA-Replikation in der Instandhaltung der Genomstabilität weit hinter der Initiation der Replikation hinterher. Und während einzelner Gene, deren späte Replikation mit Krankheit assoziiert wurde, mit z. B. qPCR10, globale Studien zur Aufklärung der Standorte und die zugrunde liegenden Ursachen der letzten Replikation gefehlt untersucht worden. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir uns beziehen, um als “G2 Seq” Wir Durchflusszytometrie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung verbinden Aufschluss über die Vollendung des Genoms Replikation in Hefe-11. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auf alle Zellen angepasst werden, die Strömung nach DNA-Gehalt sortiert werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:
(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Vert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschuss NIH GM117446 an A.B
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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