Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer
Summary
Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.
Abstract
De invasie en migratie mogelijkheden van tumorcellen zijn grootste bijdragen aan de progressie van kanker en herhaling. Vele studies hebben onderzocht de migratie en invasie capaciteiten om te begrijpen hoe kankercellen verspreiden, met het doel van de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën. Analyse van de cellulaire en moleculaire basis van deze capaciteiten heeft geleid tot de karakterisatie van cel mobiliteit en de fysisch-chemische eigenschappen van het cytoskelet en mobiele communicatie. Voor vele jaren, de bepaling van Boyden kamer en de kras wond assay geweest de standaardtechnieken cel invasie en migratie te gaan studeren. Deze twee technieken hebben echter beperkingen. De bepaling van de kamer Boyden is moeilijk en tijdrovend, en de bepaling van de kras wond heeft lage reproduceerbaarheid. Ontwikkeling van moderne technologieën, met name in microscopie, is de reproduceerbaarheid van de kras wond assay toegenomen. Met behulp van krachtige analysesystemen, kan een “in-incubator” video Microscoop worden gebruikt om automatisch en real-time analyse van cel migratie en invasie. Het doel van deze paper is te rapporteren en vergelijken van de twee tests gebruikt bij het bestuderen van de cel invasie en migratie: de bepaling van Boyden kamer en een geoptimaliseerde in vitro video Microscoop gebaseerde scratch wond assay.
Introduction
Cel invasie en migratie zijn betrokken bij de verspreiding van kankercellen, die de belangrijkste oorzaak van resistentie tegen behandeling1 en kunnen leiden tot regionale of metastatische herhaling na kanker behandeling2. De epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) is het eerste proces van cel invasie-migratie in welke kanker cellen van een epitheelweefsel naar een mesenchymale fenotype overschakelen. E-cadherine is een extracellulaire marker van de epitheliale fenotype-3en verhoogde expressie van N-cadherine en vimentin is kenmerkend voor de mesenchymale fenotype4. Migratie hangt ook de intrinsieke vermogen van kankercellen te vallen van de extracellulaire matrix (ECM) door de werking van matrix metalloproteasen5.
Dit mechanisme invasie-migratie is beschreven voor kanker op vele locaties, met name in hoofd en nek kanker6. Veel onderzoekers hebben gericht op de migratie en invasie processen beter te begrijpen hoe de verspreiding van de kankercellen in de hoop dat deze kennis tot nieuwe behandelingsstrategieën leiden zal. Het is van cruciaal belang dat deze studies worden uitgevoerd met behulp van betrouwbare en reproduceerbare testen.
In vitro analyse van de beweeglijkheid van de cel kan worden uitdagende. Vele jaren geleden ontwikkeld, de bepaling van Boyden kamer wordt beschouwd als de standaard voor invasie – migratie analyse7. Echter, het is tijdrovend en vaak onjuist is. Een tweede test is de wond-genezing assay8, waarbij een kras op een celkweek enkelgelaagde maken en vastleggen van beelden van cel invasie en migratie op vaste tijdstippen. Deze techniek is breed bekritiseerd wegens de grote verschillen tussen de resultaten van twee opeenvolgende tests. De toepassing van moderne technologieën, met name in microscopie, heeft echter de reproduceerbaarheid van de kras wond assay verbeterd. Video microscopen kunnen gemakkelijk worden ingevoerd in voorbroeders en real-time beelden van cel migratie kunnen genereren. Deze apparaten registreren microscopische gegevens en voorzien van automatische analyse van de wond cel samenvloeiing na verloop van tijd. Het doel van deze paper is om de bepaling van Boyden kamer en de geoptimaliseerde kras wond bepaling te beschrijven en te discussiëren over de voordelen en de zwakke punten van elke methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij rapporteren hier twee verschillende modaliteiten te bestuderen van de cel invasie en migratie-proces. De analyse van dit proces is belangrijk voor het begrip van de factoren die betrokken zijn bij gemetastaseerde herhaling, die zou kunnen worden verklaard door de verhoogde motiliteit van een subpopulatie van kankercellen genoemd kanker stamcellen10,11.
Het experiment van Boyden kamer behoort tot de meest gebruikte technieken om te …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze technieken werden ontwikkeld met de steun van LabEx PRIEMGETALLEN (ANR-11-LABX-0063), de Contrat Plan-Etat-regio (CPER) in het wetenschappelijke kader van ETOILE (CPER 2009-2013), en lyrische Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
