Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden
Summary
Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.
Abstract
A capacidade de invasão e migração de células tumorais é principais contribuintes para a progressão do câncer e recorrência. Muitos estudos têm explorado as capacidades de migração e invasão de entender como as células cancerosas se disseminar, com o objectivo de desenvolver novas estratégias de tratamento. Análise das bases celulares e moleculares destas habilidades levou para a caracterização da mobilidade celular e as propriedades físico-químicas do citoesqueleto e microambiente celular. Por muitos anos, o ensaio de câmara Boyden e o risco de ferimento ensaio foram as técnicas padrão para estudar a migração e invasão celular. No entanto, estas duas técnicas têm limitações. O ensaio de câmara Boyden é difícil e demorado, e o ensaio da ferida zero tem baixa reprodutibilidade. Desenvolvimento de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, aumentou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Utilizando sistemas de análise poderosas, um microscópio de vídeo de “no-incubadora” pode ser usado para fornecer análise automática e em tempo real de migração celular e invasão. O objetivo deste trabalho é relatar e comparar os dois ensaios utilizados para estudar a migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e um otimizado em vitro vídeo microscópio com base em zero do ensaio de ferida.
Introduction
Migração e invasão celular estão envolvidas na disseminação das células cancerosas, que é a causa principal da resistência ao tratamento1 e podem levar a locorregional ou metastática recorrência após tratamento de câncer2. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é o processo inicial de invasão-migração celular no qual câncer células alternar de um epitélio para um fenótipo mesenquimal. E-caderina é um marcador extracelular do fenótipo epiteliais3e expressão aumentada de N-caderina e vimentina é característica do fenótipo mesenquimais4. Migração também depende da capacidade intrínseca das células cancerosas invadir a matriz extracelular (ECM) através da ação das metaloproteases de matriz5.
Esse mecanismo de invasão – migração tem sido descrito por câncer em muitos locais, particularmente no câncer de cabeça e pescoço6. Muitos pesquisadores têm incidido sobre os processos de migração e invasão de entender melhor como as células cancerosas se disseminar na esperança de que esse conhecimento vai levar a novas estratégias de tratamento. É fundamental que estes estudos são realizados utilizando ensaios confiáveis e reproduzíveis.
Análise in vitro da motilidade celular pode ser um desafio. O ensaio de câmara Boyden desenvolveu há muitos anos, é considerado para ser o padrão para análise de invasão – migração7. No entanto, é demorado e muitas vezes é impreciso. Um segundo teste é a cicatrização da ferida ensaio8, que envolve fazer um arranhão em uma cultura celular de monocamadas e captura de imagens da invasão celular e migração em intervalos de tempo fixo. Esta técnica tem sido criticada extensamente por causa das grandes variações entre os resultados de dois testes sucessivos. No entanto, a aplicação de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, melhorou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Microscópios de vídeo podem ser facilmente introduzidos em incubadoras e podem gerar imagens em tempo real de migração celular. Estes dispositivos gravar dados microscópicos e fornecem análise automática de confluência de célula ferida ao longo do tempo. O objetivo deste trabalho é descrever o ensaio de câmara Boyden e o ensaio da ferida zero otimizada e discutir as vantagens e fraquezas de cada abordagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós relatamos aqui duas modalidades diferentes para estudar o processo de migração e invasão celular. A análise deste processo é importante para a compreensão dos factores envolvidos na recorrência metastática, que pode ser explicada pelo aumento da mobilidade de uma subpopulação de células de câncer chamado câncer células-tronco10,11.
O experimento de câmara de Boyden é uma o mais frequentemente usado invasão e migra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estas técnicas foram desenvolvidas com o apoio do LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), o plano Contrat-Etat-região (CPER) no âmbito científico da ETOILE (CPER 2009-2013) e lírica Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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