सेल आक्रमण और प्रवासन प्रक्रिया का मूल्यांकन: वीडियो माइक्रोस्कोप की तुलना-खरोंच घाव परख और Boyden चैंबर परख आधारित
Summary
इस अध्ययन सेल आक्रमण और प्रवास के विश्लेषण के लिए दो अलग तरीके रिपोर्ट: Boyden चैंबर परख और इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोप पर आधारित घाव-चिकित्सा परख । इन दोनों प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया जाता है, और उनके लाभ और हानि की तुलना की जाती है ।
Abstract
आक्रमण और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास क्षमताओं कैंसर प्रगति और पुनरावृत्ति के लिए मुख्य योगदान कर रहे हैं । कई अध्ययनों से पता लगाया है प्रवासन और आक्रमण क्षमताओं को समझने की कैसे कैंसर कोशिकाओं का प्रसार, नए उपचार रणनीतियों के विकास के उद्देश्य के साथ । सेलुलर और इन क्षमताओं का आणविक आधार का विश्लेषण सेल गतिशीलता और cytoskeleton और सेलुलर microenvironment के भौतिक गुणों के लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व किया गया है । कई वर्षों के लिए, Boyden चैंबर परख और खरोंच घाव परख मानक तकनीकों को सेल आक्रमण और प्रवास का अध्ययन किया गया है । हालांकि, इन दो तकनीकों में सीमाएं हैं । Boyden चैंबर परख मुश्किल और समय लगता है, और खरोंच घाव परख कम reproducibility है । आधुनिक प्रौद्योगिकियों के विकास, विशेष रूप से माइक्रोस्कोपी में, खरोंच घाव परख के reproducibility वृद्धि हुई है । शक्तिशाली विश्लेषण प्रणाली, एक “में-मशीन” वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए स्वचालित और सेल प्रवास और आक्रमण के वास्तविक समय विश्लेषण प्रदान किया जा सकता है । इस कागज का उद्देश्य रिपोर्ट और दो सेल आक्रमण और प्रवास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया परख: Boyden चैंबर परख और एक अनुकूलित इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोप पर आधारित खरोंच घाव परख की तुलना में है ।
Introduction
कोशिका आक्रमण और प्रवास कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में शामिल हैं, जो उपचार के लिए प्रतिरोध का मुख्य कारण है1 और कैंसर के उपचार के बाद locoregional या मेटास्टेटिक पुनरावृत्ति करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं2. उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) सेल आक्रमण की प्रारंभिक प्रक्रिया है-माइग्रेशन जिसमें कैंसर कोशिकाओं एक उपकला से एक mesenchymal phenotype के लिए स्विच. ई-Cadherin उपकला phenotype3की एक extracellular मार्कर है, और N की वृद्धि की अभिव्यक्ति-Cadherin और vimentin mesenchymal phenotype4की विशेषता है. प्रवासन भी कैंसर कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता पर निर्भर करता है extracellular मैट्रिक्स (ECM) की कार्रवाई के माध्यम से आक्रमण करने के लिए मैट्रिक्स metalloproteases5।
इस आक्रमण-प्रवासन तंत्र कई स्थानों पर कैंसर के लिए वर्णित किया गया है, विशेष रूप से सिर और गर्दन के कैंसर में6। कई शोधकर्ताओं ने प्रवास और आक्रमण प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है बेहतर समझ कैसे कैंसर कोशिकाओं को उंमीद है कि इस ज्ञान को नए उपचार रणनीतियों को बढ़ावा मिलेगा में प्रसार । यह महत्वपूर्ण है कि इन अध्ययनों विश्वसनीय और प्रतिलिपि परख का उपयोग किया जाता है ।
इन विट्रो में सेल गतिशीलता का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कई साल पहले विकसित, Boyden चैंबर परख आक्रमण के लिए मानक माना जाता है-प्रवासन विश्लेषण7। हालांकि, यह समय लगता है और अक्सर गलत है । एक दूसरे परीक्षण घाव-चिकित्सा परख8है, जो एक सेल monolayer संस्कृति पर एक खरोंच बनाने और निश्चित समय अंतराल पर सेल आक्रमण और प्रवास की छवियों पर कब्जा करना शामिल है । इस तकनीक की वजह से दो क्रमिक परीक्षणों के परिणामों के बीच बड़े बदलावों की व्यापक रूप से आलोचना की गई है. हालांकि, आधुनिक प्रौद्योगिकियों के आवेदन, विशेष रूप से माइक्रोस्कोपी में, खरोंच घाव परख के reproducibility में सुधार हुआ है । वीडियो सूक्ष्मदर्शी आसानी से मशीन में पेश किया जा सकता है और सेल प्रवास के वास्तविक समय छवियों को उत्पंन कर सकते हैं । इन उपकरणों सूक्ष्म डेटा रिकॉर्ड और समय के साथ घाव सेल संगम का स्वत: विश्लेषण प्रदान करते हैं । इस कागज का उद्देश्य Boyden चैंबर परख और अनुकूलित खरोंच घाव परख का वर्णन है, और लाभ और प्रत्येक दृष्टिकोण की कमजोरियों पर चर्चा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल आक्रमण और माइग्रेशन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए हम यहाँ दो विभिन्न मोडलों की रिपोर्ट करते हैं । इस प्रक्रिया का विश्लेषण मेटास्टेटिक पुनरावर्तन में शामिल कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन तकनीकों को LabEx प्राइमर्स (ANR-11-LABX-००६३), Contrat प्लान-Etat-रीजन (CPER) के वैज्ञानिक ढांचे के भीतर ETOILE (CPER 2009-2013), और गीतकार ग्रांट इंका-DGOS-४६६४ के सहयोग से विकसित किया गया ।
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
