디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Summary

디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.

Abstract

정확 하 게 감지 하 고 스파스 세균 샘플 세 의료 진단, 및 로봇 식 임무를 다른 행 성과 태양계의 위성에 의해 생활 탐지에 대 한 음식, 음료, 제약 공업, 많은 응용 프로그램 있다. 현재, 스파스 세균 샘플은 문화 도금 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 의해 계산 됩니다. 문화 접시 필요 오래 부 화 시간 (주 일) 하며 epifluorescence 현미경 광범위 한 얼룩 및 샘플의 농도. 여기, 꺼짐-축 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 매우 희석 문화 (100-10⁴ 셀/mL)에 박테리아를 열거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 사용자 지정 DHM의 건설 건물 저가 악기에 자세한 지침과 함께 설명 되어 있습니다. 홀로 그래피의 원리를 설명 하 고 통계 모델 동영상 해야 얼마나 오래 추정 하는 데 사용은 악기의 광학 성능 특성 및 세균 솔루션 (표 2)의 농도에 따라 셀을 검출 하 . 10 셀의 비디오 검색⁵, 10⁴, 10³및 100 셀/mL 유엔 재건된 홀로그램을 사용 하 여 실시간으로에서 설명 된다. 진폭 및 위상 이미지의 개조는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 보여 줍니다.

Introduction

매우 희석 샘플에 정확한 세균의 결정은 많은 응용 프로그램에서 중요 한: 몇 가지 예는 물과 식품 품질 분석^1,,23; 혈액, 중추 신 경계, 또는 래^4,5;에 병원 균의 검출 메 마른 물⁶;를 포함 하 여 제약 제품의 생산 그리고 오픈 바다와 퇴적 물^7,,89같은 oligotrophic 환경에서 환경 지역 사회 분석. 또한 목성과 토성, 특히 유로 파^10,11 , Enceladus^12,13, 의 얼음 위성에 가능한 현존 미생물 생명의 검출에 대 한 관심 증가 ¹⁴, 표면 액체 바다를 알려져 있습니다. 1978 년에서 바이킹 이후 아무 미션이 다른 행성에 현존 생활을 찾을 하려고, 때문에 기술 및 세균성 식별 및 공간 임무¹⁵동안 계산을 위한 계기의 한정 된 개발이 되었습니다.

판 수의 전통적인 방법의 찾을 culturable 셀만, 때로는 환경 긴장에 종의 소수를 표현할 수 있는 < 1¹⁶. 플레이트 일 또는 외피의 주 변형에 따라 최대 성공을 위해 필요 합니다. Epifluorescence 현미경 검사 법은 신속 하 고 정확한 미생물 열거형에 대 한 황금 표준으로 크게 접시 계산을 대체 했다. 핵 산 라벨 형광 염료 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR 녹색 또는 acridine 오렌지 같은 핵 산을 바인딩하는 일반적인 염료 사용^17,,1819 하지만 많은 연구를 사용 하 여 그램의 형광 표시기 서명^{20,,2122,,2324}. ML 당 10 ~⁵ 셀의 검출 (Lod)의 한계를 이끌어 전 농도 단계 없이 이러한 방법을 사용 하 여. LoD 향상 된 여과 사용 하 여 가능 하다입니다. 액체 샘플 막, 일반적으로 폴 리 카보 네이트를 이상적으로 줄이기 위해 배경 검정에 진공 필터링입니다. 저 배경 염료와 같은 위에서 언급 한 DNA 얼룩 필터²⁵에 직접 적용할 수 있습니다. 눈으로 정확한 계산에 대 한 10 ~⁵ 셀 필터, mL 당 10 ~⁵ 셀 보다 더 희석 샘플에 대 한 즉 당 필요한, 중요 한 샘플 볼륨을 수집 하 고 필터링 해야 합니다. 레이저 검사 장치 필터의 모든 영역을 체계적으로 탐구 하 고 따라서 mL²⁶당 10 ~² 셀 아래로 탐지의 한계를 밀고, 계산에 필요한 셀의 수를 줄이기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 이들은 대부분 실험실에서 사용할 수 있습니다 그리고 정교한 하드웨어 뿐 아니라 소프트웨어 전문가 확인 입자를 관찰 하는 허용 하 고 박테리아와 파편 하지.

참고로, 패 혈 증으로 성인 보통 시작에서 증상을 보여주는 < 셀/100ml의 혈액, 및에서 유아 < 10 셀/mL. 성인에서 혈액 무승부 소요 10 mL, 유아, 1 mL에서. PCR 기반 방법 인간과 비 병원 성 식물 DNA의 존재에 의해 및 혈액^27,28구성 요소 PCR 억제 저해 됩니다. 다양 한 새로운 기술에도 불구 하 고 문화 전원 지역 또는 개발 도상 국가에서 특히 혈 류 감염의 진단에 대 한 황금 표준 남아 있습니다. 다른 행성에 생활의 탐지, 열역학 계산 생활을 따라서 예상된 가능한 바이오 매스 에너지 예산을 추정할 수 있다. 1-100 셀/mL 유로 파²⁹에 열역학으로 합리적인 것으로 예상 된다. 그것은 쉽게 이러한 숫자에서 볼는 수성 해결책의 다량에 있는 세포의 아주 작은 숫자의 발견은 중요 한 미해결된 문제를 수 있습니다.

이 논문에서는, 10의 농도에서 Serratia marcescens 및 Shewanella oneidensis (야생 형 및 비 운동 돌연변이)의 탐지 설명⁵, 10⁴, 10³및 꺼짐-축을 사용 하 여 100 셀/mL 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) DHM의 주요 장점은 전통적인 가벼운 현미경 검사 법은 높은 해상도에서 두꺼운 샘플 볼륨의 동시 영상-이 구현에서 샘플 챔버는 0.8 m m 두께. 이러한 샘플 챔버는 소프트-리소 그래피입니다 (PDMS) 정밀 가공 알루미늄 몰드에서의 허용 오차는 ± 50 µ m에 의해 건설 되었다. 이 고 전력 가벼운 현미경 검사 법을 통해 필드의 깊이에 약 100 개선을 나타냅니다. 또한 DHM 광학 경로 길이 (굴절률과 두께의 제품)의 측정에 대 한 허용 하 양적 위상 정보를 제공 합니다. DHM와 유사한 기술을 사용 되었습니다 모니터링 박테리아와 효 모 세포 주기 및 세균 건조 질량^30,,3132;의 계산 산란 차이점도 세균성 긴장³³을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.

우리가 사용 하는 악기 이전 게시^34,35, 미생물와 함께 사용 사용자 이며 그것의 디자인 및 건축 시연 및 설명. 수성 솔루션 통해 주사기 펌프; 0.25 µ L 볼륨 샘플 챔버에 지속적으로 공급 된다 흐름 율은 전체 샘플 볼륨의 이미지를 보장 하기 위해 카메라 프레임 속도 의해 결정 됩니다. 통계 계산 주어진된 농도에서 세포의 상당수를 탐지 하기 위해 몇 군데 해야 합니다 샘플 볼륨의 수를 예측 합니다.

셀-감지 응용 프로그램 진폭 및 위상 이미지에 홀로그램의 재건은 필요; 분석은 원시 홀로그램에서 수행 되었다. 이 저장 계산 리소스 및 디스크 공간: 500mb 홀로그램 비디오 1-2 결핵 때 재건 될 것입니다. 그러나, 우리는 홀로그램 원하는 종 나타내는 확인 하는 샘플의 깊이 통해 재건 논의 할. DHM의 중요 한 기능 강도 및 이미지의 단계를 모니터링 하는 기능입니다. 강도 (예: 대부분의 생물 세포)에 거의 투명 한 유기 단계에서 명확 하 게 표시 됩니다. 그것은 레이블 없는 기술, 아니 염료 사용 됩니다. 이 한가능한 우주 비행 용, 염료는 임무의 조건을 살아날 수 있습니다 이후 dvantage 및-더 중요 한 것은-외계 생물, 인코딩에 대 한 DNA 또는 RNA를 사용 하지 않을 수 있습니다 작업으로 간주 될 수 없습니다. 북극과 남극, 염료 원격 위치를 데 려 어려울 수 있습니다 및 저장 시 저하 될 수 있습니다 같은 극한 환경에서 작업에 대 한 장점 이기도 합니다. 위상 및 진폭으로 이미지의 개조는 우리가 만든 사용할 수 GitHub (샴푸)에 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.

Protocol

1. 성장과 열거형의 박테리아 참고: 이것은 적절 한 매체 36에서 자란 거의 모든 세균성 긴장에 적용 됩니다. 우리의 예제에서 우리는 세 사용: Serratia marcescens 일반적인, 쉽게 식별 연구소 스트레인;로 그리고 작은, 높게 운동 환경 부담, Shewanella oneidensis 미스터-1. 비교의 비 운동 세포, 비 운동 Shewanella 돌연변이, Δ 대 운동 FlgM, 또한 사용 ?…

Representative Results

결과 DHM로 매우 낮은 수준에서 생활 하 고 죽은 박테리아를 감지 하는 능력을 표시 해야 합니다. 계산 하는 박테리아의 수는 Petroff 하우저 세 실과 접시 수를 사용 하 여 얻은 결과와 일관 되어야 합니다. 표준 통계 방법을 다양 한 세균성 농도에서 다른 검출 방법의 정확성에 대 한 정보를 제공합니다. 그림 1</str…

Discussion

홀로그램의 수치 재건: 홀로그램의 숫자 재건, 각도 스펙트럼 방법 (ASM) 사용 됩니다. 이 DHM의 그린의 기능으로 홀로그램의 회선을 포함 한다. 특정 초점면에서 이미지의 복잡 한 wavefront 푸리에 회선 정리를 다음과 같이 채용 하 여 계산할 수 있다:

(1)

어디 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56343/…

Materials

Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7710	Many options for purchase
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 cm Petri dishes	VWR	10053-704
15 mL culture tubes	Falcon (Corning Life Sciences)	352002	Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow	Nalgene	8000-0004	Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
Open-source software	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo