Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Manuel Bedrossian; Casey Barr; Chris A. Lindensmith; Kenneth Nealson; Jay L. Nadeau

doi:10.3791/56343

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Bioengineering

Quantification des microorganismes à des Concentrations faibles en utilisant la microscopie holographique numérique (DHM)

Published: November 01, 2017

doi:

10.3791/56343

Manuel Bedrossian, Casey Barr, Chris A. Lindensmith, Kenneth Nealson, Jay L. Nadeau

¹Department of Medical Engineering,California Institute of Technology, ²Department of Earth Sciences,University of Southern California, ³Jet Propulsion Laboratory,California Institute of Technology

Summary

La microscopie holographique numérique (DHM) est une technique volumétrique qui permet aux échantillons d’imagerie 50-100 X plus épais que la microscopie fond clair à une résolution comparable, avec mise au point effectuée post-traitement. Ici DHM est utilisé pour l’identification, comptage et suivi des microorganismes à très faible densité et par rapport aux mesures de la densité optique, teneur en germes et dénombrement direct.

Abstract

Avec précision, détecter et compter les rares échantillons bactériens a de nombreuses applications dans les aliments, des boissons et des industries de transformation pharmaceutique, dans le domaine du diagnostic médical et pour la détection de la vie par les missions robotiques vers d’autres planètes et lunes du système solaire. Actuellement, les rares échantillons bactériens sont comptés par microscopie à épifluorescence ou de placage culture. Plaques de culture ont besoin de temps d’incubation fois (quelques jours ou semaines) et microscopie à épifluorescence requiert coloration étendue et la concentration de l’échantillon. Ici, nous montrent comment utiliser la microscopie holographique numérique hors-axe (DHM) pour énumérer les bactéries dans des cultures très diluées (100-10⁴ cellules/mL). Tout d’abord, la construction de la DHM personnalisé est discutée, ainsi que des instructions détaillées sur la construction d’un instrument peu coûteux. Les principes de l’holographie sont discutés, et un modèle statistique est utilisé pour estimer combien de temps les vidéos devraient être de détecter des cellules, selon les caractéristiques de performances optiques de l’instrument et la concentration de la solution bactérienne (tableau 2) . Détection vidéo des cellules à 10⁵, 10⁴, 10³et 100 cellules/mL est démontrée en temps réel à l’aide d’hologrammes non reconstituées. Reconstruction d’images d’amplitude et de phase est démontrée à l’aide d’un package de logiciels libres.

Introduction

Détermination de précise nombre de bactéries dans des échantillons très diluées est cruciale pour de nombreuses applications : quelques exemples sont l’eau et la nourriture qualité analyse¹^,²^,³; détection de pathogènes dans le sang, liquide céphalo-rachidien ou expectorations⁴^,⁵; production de produits pharmaceutiques, y compris l’eau stérile,⁶; et analyse de la communauté environnementale dans des milieux oligotrophes tels que l’ouverture océanique et les sédiments⁷^,⁸^,⁹. Il y aussi un intérêt croissant dans la détection de possibles formes de vie microbiennes existantes sur les lunes glacées de Jupiter et de Saturne, notamment Europa¹⁰^,¹¹ et Encelade¹²^,¹³^, ¹⁴, qui sont connus pour avoir des Océans liquides sous la surface. Parce qu’aucune mission depuis Viking en 1978 n’a tenté de trouver une vie existante sur une autre planète, il y a eu un développement limité des technologies et des instruments pour l’identification bactérienne et compter au cours de missions spatiales¹⁵.

Les méthodes traditionnelles de la teneur en germes trouver uniquement les cellules cultivables, qui peuvent représenter une minorité d’espèces dans les souches environnementales, parfois < 1 %¹⁶. Plaques nécessitent quelques jours ou semaines d’incubation pour une réussite maximale, selon la souche. Microscopie à épifluorescence a largement remplacé les dénombrements comme l’étalon-or pour dénombrement microbien rapide et précise. Acide nucléique-marquage fluorescents colorants tels que 4′, dichlorhydrate de 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), SYBR Green ou l’acridine orange qui se lient aux acides nucléiques sont les colorants typique utilisés¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ , bien que de nombreuses études utilisent des indicateurs fluorescents de gramme signent²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. Grâce à ces méthodes sans étapes de préconcentration mène aux limites de détection (LOD) ~ 10⁵ cellules / mL. Améliorations de LoD sont possibles à l’aide de filtration. Un échantillon de liquide est filtré sous vide sur une membrane, généralement en polycarbonate et idéalement noir pour réduire le fond. Bas-fond colorants tels que les taches d’ADN mentionnés ci-dessus peuvent être appliquées directement sur le filtre²⁵. Pour le comptage précis par oeil, 10 ~⁵ cellules sont tenus par le filtre, ce qui signifie que pour les échantillons plus diluées que ~ 10⁵ cellules / mL, volumes d’échantillon significatif doivent être recueillies et filtrées. Laser à balayage ont été développées afin d’explorer systématiquement toutes les régions du filtre et ainsi réduire le nombre de cellules nécessaires pour le comptage, repousser les limites de détection vers le bas pour ~ 10² cellules par mL,²⁶. Toutefois, ceux-ci ne sont pas disponibles dans la plupart des laboratoires et nécessitent un matériel sophistiqué ainsi que les logiciels permettant la confirmation expertise celui observé des particules sont bactéries et pas de débris.

Pour référence, adultes atteints de septicémie habituellement commencent à montrer des symptômes à < 100 cellules/mL de sang et les nourrissons à < 10 cellules/mL. Un tirage de sang d’un adulte a 10 mL et d’un nourrisson, 1 mL. Méthodes basées sur la PCR sont inhibées par la présence de la flore humaine et non pathogènes ADN et composants inhibant la PCR dans le sang²⁷^,²⁸. Malgré la variété des techniques émergentes, les cultures restent l’étalon-or pour le diagnostic des septicémies, en particulier dans les zones plus rurales ou en voie de développement. Pour la détection de vie sur d’autres planètes, calculs thermodynamiques peuvent estimer le budget énergie pour la vie et donc de la biomasse possible attendue. 1 – 100 cellules/mL sont censés être thermodynamiquement raisonnable sur Europa²⁹. Il peut être facilement vu de ces chiffres que la détection d’un très petit nombre de cellules de grandes quantités de solution aqueuse est un important problème non résolu.

Dans cet article, nous démontrons la détection de Serratia marcescens et Shewanella oneidensis (mutant sauvage et non mobile) à des concentrations de 10⁵, 10⁴, 10³et 100 cellules/mL à l’aide d’un hors-axe microscope holographique numérique (DHM). Le principal avantage du DHM sur la microscopie traditionnelle est l’imagerie simultanée d’un volume d’échantillon épais à haute résolution — dans cette implémentation, la chambre de l’échantillon était de 0,8 mm d’épaisseur. Ces chambres de l’échantillon ont été construits par la douce-lithographie de polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir d’un moule de précision en aluminium avec une tolérance de ± 50 µm. Cela représente une amélioration d’environ 100 fois en profondeur de champ sur la microscopie photonique haute puissance. DHM fournit également des informations de la phase quantitative, permettant des mesures de la longueur du trajet optique (produit de l’indice de réfraction et de l’épaisseur). DHM et des techniques similaires ont été utilisées pour la surveillance des bactéries et cycle de cellules de levure et calcul de la masse bactérienne sèche³⁰^,³¹^,³²; différences de diffusion peuvent même être utilisés pour différencier les souches bactériennes³³.

L’instrument que nous utilisons est sur mesure spécifiquement pour une utilisation avec des microorganismes, comme précédemment publié³⁴^,³⁵, et sa conception et sa construction sont démontrés et discutées. Solutions aqueuses sont fournies en permanence à une chambre de mesure de volume µL 0,25 par pousse-seringue ; le débit est déterminé par la fréquence d’images de caméra afin d’assurer l’imagerie volume de l’échantillon entier. Un calcul statistique permet de prédire le nombre de volumes d’échantillon qui doit être copié afin de détecter un nombre significatif de cellules à une concentration donnée.

Pour des applications de détection des cellules, la reconstruction des hologrammes dans l’amplitude et la phase des images n’était pas nécessaire ; analyse a été réalisée sur l’hologramme brute. Cela permet d’économiser des ressources informatiques importants et l’espace disque : un hologramme de 500 Mo vidéo sera de 1 à 2 to quand reconstruits. Toutefois, nous discutons reconstruction par profondeur de l’échantillon pour confirmer que les hologrammes représentent l’espèce désirée. Une caractéristique importante du DHM est sa capacité à contrôler l’intensité et la phase des images. Les organismes qui sont presque transparentes en intensité (comme la plupart des cellules biologiques) apparaissent clairement en phase. Comme il s’agit d’une technique exempte d’étiquette, aucun colorants ne sont utilisés. Il s’agit d’un unVantage pour des applications possibles de vol spatial, puisque les colorants ne peuvent pas survivre aux conditions d’une mission et — surtout — ne peut présumer de travailler avec des organismes extraterrestres, qui ne pourraient pas utiliser l’ADN ou ARN pour l’encodage. C’est aussi un avantage pour le travail dans des conditions extrêmes telles que l’Arctique et l’Antarctique, où les colorants peuvent être difficiles à apporter à l’emplacement distant et peuvent se dégrader après stockage. Reconstruction d’images en phase et en amplitude est effectuée à l’aide d’un package de logiciels open-source que nous proposons sur GitHub (shampooing) ou ImageJ.

Protocol

1. croissance et énumération des bactéries Remarque : Ceci s’applique à presque n’importe quelle souche bactérienne cultivé dans le moyen approprié 36. Dans notre exemple, nous utilisons trois souches : Serratia marcescens comme étant une souche commune, easy lab identifiable ; et une souche environnementale plus petite et fortement motile, Shewanella oneidensis MR-1. Pour comparer la détection de motile vs cellules non mobile, non mot…

Representative Results

Devrait permettre d’établir la capacité de détecter les bactéries mortes et vivantes à des niveaux très bas par DHM. Le nombre de bactéries compté doit être cohérent avec les résultats obtenus avec les comtes chambre et plaque de comptage de Petroff-Hauser. Méthodes statistiques standards fournissent des informations quant à l’exactitude des méthodes de détection différentes à différentes concentrations bactériennes. <p class="jove_content" fo:keep-together.with…

Discussion

Reconstruction numérique d’hologrammes: pour la reconstruction numérique d’hologrammes, la méthode de spectre angulaire (ASM) est utilisée. Il s’agit de la convolution de l’hologramme avec la fonction de Green pour le DHM. Le front d’onde complexe de l’image dans un plan focal particulière peut être calculé en utilisant le théorème de Fourier Convolution comme suit :

(1)

<p class="jove_c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le Gordon et Betty Moore Foundation subventions 4037 et 4038 à la California Institute of Technology pour le financement de ces travaux.

Materials

Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7710	Many options for purchase
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 cm Petri dishes	VWR	10053-704
15 mL culture tubes	Falcon (Corning Life Sciences)	352002	Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow	Nalgene	8000-0004	Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
Open-source software	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).