Summary

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

Published: January 14, 2018
doi:

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

Abstract

פספוסים דם אנושי, עלקת הבילהרציה spp., יש מחזור חיים מורכב שמערב שלבים התפתחותיים אל-זוויגית, מיניות בתוך השבלול ביניים, יונקים הסופי מארח, בהתאמה. היכולת לבודד ולקיים את שלבי מחזור החיים שונים בתנאים תרבות ‘ במבחנה הנחתה במידה רבה את חקירות של המנגנונים הסלולר, הביוכימי והמולקולרי ויסות טפיל צמיחה, פיתוח, מארח אינטראקציות. שידור של בילהרציה דורש רבייה אל-זוויגית ופיתוח של שלבים רבים זחל בתוך שבלול המארח; מ miracidium זיהומיות, דרך sporocysts ראשיים ומשניים, ועד השלב הסופי cercarial זה מסוגל להזיק לבני. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור המוני הבקיעה ובידוד של עלקת הבילהרציה mansoni miracidia מביצים המתקבל הכבדים של עכברים נגועים, מבוא עוקבות שלהם לתוך התרבות במבחנה . הוא צפוי כי פרוטוקול מפורט יעודד חוקרים חדשים לעסוק ולהרחיב שדה חשוב זה של מחקר schistosome.

Introduction

האדם דם spp. עלקת הבילהרציה פספוסים, הסוכנים סיבתי של בילהרציה, מחלה טרופית מוזנח מתעצמת משוער 230 מיליון בני אדם ברחבי העולם1. המין הנפוץ ביותר, עלקת הבילהרציה mansoni, מופץ גיאוגרפית בדרום אמריקה, האיים הקריביים, המזרח התיכון, אפריקה לסהרה2. מחזור החיים של S. mansoni, ו schistosomes אחרים, היא מורכבת, מעורבים שורה מהווים הסופית יונקים ו חלזונות מים מתוקים של הסוג Biomphalaria המשמשים כפונדקאים ביניים בלבד.

S. mansoni מבוגר זכר ונקבה תולעת זוגות המתגוררים וורידי מצע המעי העליון האחורי להתרבות בתרבית של המארח, וכתוצאה מכך שחרורו של embryonated ביציות (פשוט) זה להיות תקוע בעצם venules קטן של רירית המעי. הביצים ואז פורץ דרך הקירות כלי השיט, דרך רקמות mucosal והזן בסופו של דבר לומן מעיים היכן הם נמצאים בוטל עם הצואה. כאשר ביצית מזין את הצוהר הזחלים מים מתוקים, free-swimming (miracidia), שהם חייבים, סדר קצר, למצוא חילזון Biomphalaria מתאימים כדי להדביק על מנת להמשיך את מחזור חייו. תהליך זיהום זה כרוך miracidial מצורף משטח הגוף החיצוני של החילזון ואחריו חדירה פעיל, כניסה של הזחל לתוך המחשב המארח. זמן קצר לאחר הכניסה, miracidium מתחיל לשפוך צלחות אפידרמיס ciliated החיצוני שלה כמו צורות syncytium שיהפכו את המשטח החיצוני החדש (tegument) של הזחל הבא, sporocyst ראשי או אמא. דרך רבייה אל-זוויגית, כל sporocyst ראשית מייצרת ומשחרר דור שני של sporocysts, כינה משני או הבת sporocysts, אשר בתורו, לייצר ולשחרר מספר גדול של השלב הסופי intramolluscan, cercaria3 . על הבריחה מהמחשב המארח חילזון, free-swimming cercariae מסוגלים הצמדת וחודר ישירות על העור של האדם או אחר מתאים שורה יונקים. כשנכנסתי אל הפונדקאי החדש שלהם, cercariae להפוך לבמה schistosomula טפיליות ו לפלוש במערכת כלי הדם. הם, בתורו, נודדים הריאה ולאחר מכן את וריד הכבד שבו הם התבגרת. תולעים בוגרות, יוצרות זוגות זכר ונקבה, לנסוע אל הורידים מצע המעי העליון כדי להשלים את מחזור החיים שלהם.

מוצלחת intramolluscan או “חילזון שלב” התפתחות הזחל schistosomes חיוני המשכיות המחזור של שידור מארח למארח אנושי. חשיבות קריטית היא הערך הבא תקופה של miracidium free-swimming לתוך המחשב המארח חילזון וטרנספורמציה מוקדם שלה על הבמה הראשית sporocyst. בהתאם התאימות פיזיולוגי ו בין המארח לבין טפיל, זה במהלך שלב זה של התפתחות הזחל את ההצלחה הראשונית או כשל ליצור זיהומים הוא נחוש4,5,6 . עוקבות התפתחות מסוגל לייצר asexually sporocysts משני, אשר לאחר מכן ליצור cercariae אנוש-זיהומיות, ראשי sporocysts נוספות דורשות סביבה מארח פיזיולוגיים מתירניות מספק עבור כל הצמיחה של הטפיל, הרבייה צריך.

עד כה, מעט מאוד ידוע על הבסיסית פיסיולוגי, ביוכימי, תהליכים מולקולריים אינטראקציות schistosome-חילזון לשליטה, במיוחד מולקולות מסלולים מעורבים בוויסות התפתחות הזחל ורביה, או להתכוונן תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. מוכן גישה לכמויות גדולות של אלה שדרגות בתנאים in vitro לקשרי תרבות כי היתר מניפולציה ניסויית מאוד להקל על הגילוי של מסלולים התפתחותית ומנגנונים הבסיסית של צמיחת תאים, בידול רבייה… נתיבים קריטיים טפיל או מנגנונים, מזוהה באמצעות ניסויים במבחנה , יוכל לשמש לאחר מכן כדי לשבש את הזחל הצמיחה רבייה במארח חילזון, או כדי לזהות חילזון מארח המערכת החיסונית מנגנונים מעורבים זיהוי ולמניעת שלבים miracidial או sporocyst.

זה מאמר, מצגת וידאו, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה לבודד מספר רב של free-swimming S. mansoni miracidia עבור מבוא לתרבות במבחנה זה עלולים להיות נתונים מעקב ניסיוני מניפולציה (ראו איור 1 מבט סכמטי של זרימת העבודה לפרוטוקול). אף על פי נהלים דומים שתוארו קודם לכן7,8,9, הרגשנו כי פרוטוקול מפורט יהיה שימושי לחוקרים המעוניינים להעסיק. את מודל זה להפנות שאלות שלא נענו עדיין קשורים פיתוח זחל intramolluscan תאית שגשוג, אינטראקציות המערכת החיסונית schistosome-חילזון. בנוסף, גישה זו יכולה להתאים בקלות עבור בידוד של הביצים אחרים trematodes חשוב מבחינה רפואית כגון שלפוחית השתן-דיור ס haematobium, פספוסים הכבד או הריאות פספוסים.

Protocol

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון תחת פרוטוקול אין. V005717. להלן כללי התנהגות כרוך עובד במתקן אבטחה ברמה 2 (BSL2) עבור האדם פתוגנים, אף אחד השלבים schistosome מצטיירת פרוטוקול זה אמנם זיהומיות בני אדם או יונקים אח?…

Representative Results

הרוב המכריע של miracidia בדרך כלל שנאסף ב- “יבולים” שני הראשונים. דגירה של מבודדים miracidia ב CBSS + מפעיל על תהליך הטרנספורמציה miracidium-אל-sporocyst (איור 4A- C). בתוך שעה הראשונה העברה הבא לתרבות בארות המכיל CBSS +, הרוב המכריע של miracidia הפסקת שחייה (איור 4A</stron…

Discussion

Miracidia של S. mansoni, מבודד ולמניפולציה כמתואר להלן, יכול להדביק רק חילזון המארח ביניים, ולכן אינם מייצגים הביולוגי האנושי במהלך שלב זה של התפתחות הזחל. עם זאת, כדי למנוע חשיפה מקרית/זיהום של חלזונות, להקפיד לבצע miracidial ומשום במיקום שונה מאזורים שבו רגישים מינים חילזון Biomphalaria עשוי להיות …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מומן בחלקו על ידי מענק-NIH RO1AI015503. עכברים נגועים schistosome נמסרו על ידי המרכז משאב NIAID בילהרציה מכון המחקר הביו-רפואי (Rockville, MD) דרך NIH-NIAID חוזה HHSN272201000005I להפצה באמצעות משאבים BEI.

Materials

Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

References

  1. Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
  2. WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
  3. Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
  4. Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
  5. Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
  6. Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
  7. Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
  8. McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
  9. Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
  10. Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
  11. Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
  12. Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
  13. Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
  14. Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
  15. DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
  16. Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
  17. Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
  18. Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
  19. Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
  20. Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
  21. Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
  22. Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).

Play Video

Cite This Article
Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

View Video