質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養
Summary
この記事では、大型無菌免人間住血吸虫マンソン住血吸虫の自由遊泳性の miracidia のコレクションのためのプロトコルおよび生体外の文化への導入、後続の処理について説明します。
Abstract
人間住血吸虫、住血吸虫属、それぞれカタツムリ中間および哺乳類最終的なホスト、内で無性生殖と性的発達段階を含む複雑なライフ サイクルがあります。分離し、体外で培養条件下で別のライフ サイクル段階を維持する能力は寄生虫の成長、開発およびホストを制御する細胞, 生化学的および分子機構の研究を促進しています。相互作用。住血吸虫症の伝送は、無性生殖とカタツムリ ホスト内で複数の幼虫の段階の開発を必要とプライマリおよびセカンダリの sporocysts を介して感染のミラシジウムから cercarial 終盤それが人間に感染です。本稿では大量孵化とマンソン住血吸虫感染マウスと生体外で文化にその後導入の肝臓から得られた卵から miracidia の分離手順プロトコルを提案します。詳細なプロトコルに従事し、住血吸虫研究のこの重要な分野を広げる新しい研究者を奨励することも予想されます。
Introduction
人間血蛭住血吸虫属、住血吸虫症、12 億 3000 万人推定世界を苦しめる顧みられない熱帯病の病原です。最も普及している種、マンソン住血吸虫、地理的に、南アメリカ、カリブ海諸島、中東、サハラ以南のアフリカ2で配布されています。マンソン住血吸虫など、およびその他の住のライフ サイクルは、哺乳類の決定的なホストと偏の中間宿主となるBiomphalaria属の淡水の貝を含む複雑です。
マンソン住血吸虫など男性と女性の大人のワーム ペア哺乳類宿主再現の後部上腸間膜静脈に住んでいる腸内の粘膜の小さな静脈にひっかかる鶏卵 (ova) の解放に終っています。卵の血管壁壊れる粘膜組織を移行し、最終的に糞便を無効になった彼ら、腸内腔を入力がします。Ova は、淡水性で自由遊泳の幼虫 (miracidia) ハッチを入力、短いのため、そのライフ サイクルを続行するために感染に適したBiomphalariaカタツムリを見つける必要があります、彼ら。この感染プロセスには、ホストに進行中の侵入と幼虫のエントリが続いてカタツムリの外側のボディ表面に miracidial の添付ファイルが含まれます。エントリー後すぐに、ミラシジウム小屋を開始するその外側の毛表皮板次の幼虫、プライマリまたは母の sporocyst の新しい外面 (テグメントタンパク) となるシンシチウム形成。無性生殖は、各プライマリ sporocyst 生成し、二次と呼ばれる sporocysts または intramolluscan 終盤、ケルカリア3の大規模な番号を解放と生成し、順番の娘 sporocysts の第二世代をリリース.カタツムリのホストからの脱出、時に自由遊泳セルカリアは接続して人間や他の適した哺乳類宿主の皮膚を直接貫通が可能です。新しいホストへの参入、セルカリア寄生 schistosomula ステージに変換、血管のシステムに侵入します。、彼らは順番に、肺と肝静脈成虫に成熟、男性と女性のペアを形成、そのライフ サイクルを完了する上腸間膜静脈への旅行、どこを移行します。
Intramolluscan 成功または幼虫住の「カタツムリ フェーズ”開発人間ホストに転送サイクルの継続に不可欠です。重要性のカタツムリ ホストとプライマリ sporocyst 段階、初期変換に自由遊泳のミラシジウムの期間の次のエントリです。寄生虫とホスト間の生理学的および免疫学的互換性、によってそれは幼虫の開発のこの段階で、その初期の成功または感染症が決定した4,56,を確立する失敗.無性人間感染セルカリアを生成し、二次 sporocysts を作り出すことができる主な sporocysts の後続の開発はさらに寄生虫の成長のすべてを提供する寛大な生理的ホスト環境を必要と生殖が必要です。
までに、少しは知られているについて生理学的、生化学的な基礎となると住血吸虫カタツムリの相互作用を制御する分子過程、特に分子や経路に関与する幼虫の発育と生殖を規制、または変調ホストの免疫反応。体外で培養実験的操作を可能にする条件の下でこれらの幼虫の段階の多数へのアクセスが大いに促進され発達経路の発見と細胞増殖、分化のメカニズム再現。重要な寄生虫の経路やメカニズム、体外実験によって識別される可能性があります、カタツムリ ホストで幼虫の成長・再生を妨害するまたはカタツムリ ホストの認識と排除に関与する免疫メカニズムを識別するためにmiracidial または sporocyst の段階。
この記事とビデオ プレゼンテーションは、我々 提供自由遊泳マンソン住血吸虫などの大規模な番号を分離する方法の詳細については、実験のフォロー アップを受ける生体外の文化への導入 miracidia操作 (プロトコル ワークフローの概要は図 1を参照)。ただし、同様の手順を記載されている以前7,8,9, 詳細なプロトコルが関連するまだ未回答の質問に対処するこのモデルを採用する研究者に役立つだろうと感じましたintramolluscan 幼虫の発育、細胞増殖と住血吸虫カタツムリ免疫の相互作用。さらに、このアプローチは、肺吸虫や肝蛭膀胱住居S. ビルハルツなど他の医学的に重要な吸虫類からの卵の分離に適合しやすい可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
マンソン住血吸虫など、分離、本明細書で説明されているように操作の Miracidia だけカタツムリ中間ホストに感染し、幼虫の開発のこの段階で人間バイオハザードは表現していません。ただし、 Biomphalariaカタツムリ種の影響を受けやすい可能性があります存在または維持領域から別の場所に miracidial の分離を実行する、カタツムリの偶発的な暴露/感染症を避けるためには、注意…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH グラント RO1AI015503 によって部分的に資金を供給しました。住血吸虫感染マウスは備リソースを介して配布する NIH NIAID 契約 HHSN272201000005I を通じて NIAID 住血吸虫症リソース センター生物医学研究所 (メリーランド州ロックビル) によって提供されました。
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
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