Total aislamiento y cultivo In Vitro de Intramolluscan etapas de la humano platija de la sangre Schistosoma Mansoni
Summary
Este artículo describe un protocolo para el aislamiento axénico a gran escala y la colección de miracidia nadan de la humana platija de la sangre mansoni de Schistosoma y su posterior procesado para la introducción en cultivo en vitro .
Abstract
Humanas sangre trematodos, Schistosoma spp., tienen un ciclo de vida complejo que comprende las fases del desarrollo asexuales y sexuales dentro de un caracol intermedio y mamífero huésped definitivo, respectivamente. La capacidad para aislar y sostener las etapas del ciclo de vida diferente bajo condiciones de cultivo en vitro ha facilitado enormemente las investigaciones de los mecanismos celulares, bioquímicos y moleculares de regulación de host, el desarrollo y crecimiento del parásito interacciones. Transmisión de la esquistosomiasis requiere reproducción asexual y el desarrollo de múltiples etapas larvales en el host de caracol; desde el miracidium contagiosa, a través de esporocisto primaria y secundaria, a la etapa final de cercarial que es contagioso a los seres humanos. En este trabajo presentamos un protocolo paso a paso para la eclosión total y aislamiento del mansoni del schistosoma miracidia de huevos obtenidos de hígados de ratones infectados y su posterior introducción en cultivo en vitro . Se prevé que el protocolo detallado anime a nuevos investigadores y ampliar este importante campo de investigación de esquistosoma.
Introduction
El ser humano sangre platijas Schistosoma spp., son los agentes causativos de la esquistosomiasis, una enfermedad tropical desatendida que afecta a un estimado de 230 millones de personas en todo el mundo1. La especie más difundida, Schistosoma mansoni, se distribuye geográficamente en América del sur, el archipiélago Caribe, Oriente Medio y África subsahariana2. El ciclo de vida de S. mansoniy otros esquistosomas, es complejo, que implica un mamífero hospedador definitivo y los caracoles de agua dulce del género Biomphalaria que sirven como hospederos intermediarios obligados.
S. mansoni macho y hembra adulto del gusano pares viven en las venas mesentéricas posteriores de la reproducción del huésped mamífero, lo que resulta en la liberación de huevos embrionados (ova) que se metieran en las pequeñas vénulas de la mucosa intestinal. Huevos se rompe a través de las paredes del recipiente, migran a través de tejido mucoso y finalmente entrar en la luz intestinal donde son anuladas con las heces. Cuando óvulos entran las larvas nadan libremente y de agua dulce (miracidia) Portilla, deben, en poco tiempo, encontrar un caracol Biomphalaria adecuado para infectar a fin de continuar su ciclo de vida. Este proceso de infección consiste en miracidial accesorio a la superficie de cuerpo exterior de caracol seguida por la penetración activo y la entrada de la larva en el host. Pronto después de la entrada, el miracidium comienza a arrojar sus placas epidérmicas ciliadas externas como forma un sincitio se convertirá en la nueva superficie exterior (tegumento) de la siguiente etapa larval, el sporocyst primario o madre. A través de reproducción asexual, cada sporocyst primario produce y libera una segunda generación de esporoquistes, denominados secundarios o esporoquistes de hija, que a su vez, generaran y liberan grandes cantidades de la fase final de la intramolluscan, la cercaria3 . A escapar de la sede de caracol, cercariae nado libre es capaces de conectar a y penetrar directamente en la piel de un humano o de otro huésped mamífero adecuado. Al entrar en su nuevo host, cercariae transforma a la etapa de parásito esquistosómula y invade el sistema vascular. A su vez, migran a los pulmones y luego a la vena hepática donde maduran a gusanos adultos, forman pares masculinos y femeninos y viajar a las venas mesentéricas para completar su ciclo de vida.
Exitoso intramolluscan o el desarrollo de la “fase Caracol” de esquistosomas larvales es esencial para la continuación del ciclo de transmisión humana de host a host. De importancia crítica es la entrada siguiente períoda del miracidium nadan libremente en el host de caracol y su transformación temprana a la etapa del sporocyst primario. Dependiendo de la compatibilidad fisiológica e inmunológica entre huésped y parásito, es durante esta fase de desarrollo larval inicial éxito o el fracaso para establecer infecciones es determinado4,5,6 . Desarrollo posterior de esporocisto primaria capaz de producir asexualmente esporoquistes secundarios, que luego generan cercariae infeccioso en humanos, además requieren un entorno de host fisiológica permisiva que ofrece para todos los del crecimiento del parásito y necesidades de reproducción.
Hasta la fecha, poco se sabe sobre el subyacente fisiológico, bioquímico y moleculares procesos controlar las interacciones de schistosome caracol, especialmente las moléculas y vías implicados en regulación de la reproducción y desarrollo larval, o modulación de respuestas inmunitarias del huésped. Acceso a un gran número de estos estadios larvarios en condiciones en vitro cultura que permiten manipulación experimental facilitaría enormemente el descubrimiento de vías de desarrollo y los mecanismos subyacentes del crecimiento celular, diferenciación y la reproducción. Crítico parásito vías o mecanismos, identificados a través de la experimentación en vitro , podrían utilizarse para interrumpir el crecimiento/reproducción larvaria en el host de caracol, o caracol huésped inmune mecanismos implicados en el reconocimiento y eliminación de miracidial o sporocyst etapas.
En este artículo y el vídeo de presentación, ofrecemos una descripción detallada de un método para aislar gran cantidad de nado libre S. mansoni miracidia para la introducción en cultivo en vitro que luego puede ser sometida a seguimiento experimental manipulación (ver figura 1 para una descripción esquemática del flujo de trabajo de protocolo). Aunque se han descrito procedimientos similares previamente7,8,9, sentimos que un protocolo detallado sería útil a los investigadores que deseen emplear este modelo para abordar preguntas todavía sin respuesta relacionadas con intramolluscan desarrollo larvario, proliferación celular e interacciones inmunes schistosome caracol. Además, este enfoque se podría adaptar fácilmente para el aislamiento de huevos de otros trematodos médicamente importantes tales como vejiga-vivienda S. hematobium, hígado trematodos o tremátodos del pulmón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia de S. mansoni, aislados y manipulados como se describe en este documento, puede infectar solamente el anfitrión intermedio del caracol y por lo tanto no representan un riesgo biológico humano durante esta fase de desarrollo larvario. Sin embargo, para evitar la exposición accidental, infección de los caracoles, debe tenerse cuidado para realizar aislamientos miracidial en una ubicación diferente de áreas donde especies de caracoles Biomphalaria susceptibles pueden ser presente o mantenid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado en parte por subvenciones de NIH RO1AI015503. Ratones infectados de schistosome fueron proporcionados por del NIAID esquistosomiasis Resource Center en el Instituto de investigaciones biomédicas (Rockville, MD) a través de NIH NIAID contrato HHSN272201000005I para la distribución a través de recursos del BEI.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
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