Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in<em> Drosophila</em> Embryo's
Summary
Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.
Abstract
De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fagocytose van apoptotische cellen moeten meer gedetailleerd worden toegelicht wegens de rol ervan in immuun- en ontstekingsrechterlijke ziektes. We hebben hierin een experimentele methode ontwikkeld om kwagocytose kwantitatief te onderzoeken met behulp van de vruchtvlieg Drosophila , waarbij het genenetwerk dat de ontvulingsreacties beheert evolutionair wordt bewaard van zoogdieren. Om nauwkeurig op te sporen en te counteren van phagocyten met behulp van hele dieren, werden Drosophila embryo's gehomogeniseerd om gedispergeerde cellen te verkrijgen, waaronder fagocyten en apoptotische cellen. Het gebruik van gedispergeerde embryonale cellen stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus te meten alsof we een in vitro fagocytose-analyse uitvoerden waarin alle fagocyten en apoptotische cellen in hele embryo's kunnen worden waargenomen en het niveau van fagocytose nauwkeurig kwantificeren. We hebben bevestigd dat deze methode die van vorige studies weergeeftDie de genen die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen geïdentificeerd. Deze methode maakt het mogelijk om de ontploffing van dode cellen te analyseren en zal, in combinatie met de krachtige genetica van Drosophila , de complexe fagocytische reacties onthullen die bestaan uit de migratie, herkenning, verzwelling en afbraak van apoptotische cellen door fagocyten.
Introduction
Bij metazoandieren, bijvoorbeeld de nematode Caenorhabditis elegans , de vruchtvlieg Drosophila melanogaster en muizen en mensen, ondergaan een groot aantal cellen apoptose tijdens de ontwikkeling om hun lichaam en volwassenheid te vormen om homeostase 1 , 2 te behouden . Apoptotische cellen moeten snel verwijderd worden omdat ze ontsteking in de omringende weefsels veroorzaken door immunogene intracellulaire materialen vrij te laten indien niet volledig verwijderd 3 . Om de snelle verwijdering te vergemakkelijken, presenteren apoptotische cellen zogenaamde Eat-Me signalen die door de ontvulingsreceptoren van fagocyten worden herkend en worden geëlimineerd door fagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Derhalve speelt fagocytose een cruciale rol in het behoud van gastheerhomeostase, en dus de molecuul verhelderen Mechanismen die onderliggende zijn aan de fagocytose van apoptotische cellen is van belang.
De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen lijken evolutionair te behouden onder species in de nematoden, vliegen en muizen 7 . Verschillende fagocytose assays zijn momenteel beschikbaar om de opvulling van apoptotische cellen in deze modeldieren te beoordelen. In C. elegans ondergaan 131 somatische cellen geprogrammeerde celsterfte tijdens de ontwikkeling, en cellichamen worden gefagocytoseerd door naburige cellen, die niet-professionele fagocyten zijn 8 . Dus, het aantal resterende cellichamen in C. elegans telt het niveau van fagocytose in vivo . Door te zoeken naar nematode mutanten die een verhoogd aantal dode cellen aantonen, zijn verschillende genen die nodig zijn voor fagocytose geïdentificeerd en genetisch gekenmerkt 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
Ex vivo fagocytose assays met primaire cultuur fagocyten, in het algemeen macrofagen, worden vaak in muizen gebruikt. Apoptotische cellen worden bereid met behulp van cellijnen zoals Jurkat-cellen, en worden gemengd met primaire fagocyten. Na een incubatie gedurende enkele uren worden de totale aantallen fagocyten en ontvlamende fagocyten geteld om het niveau van fagocytose te beoordelen. Als een verfijnde wijziging van deze methode ontwikkelde Nagata's groep een ex vivo fagocytose-analyse met cellen die een caspase-resistente ICAD (inhibitor van caspase-geactiveerde DNase) uitdrukken, waarbij apoptotische cellen geen apoptotische DNA-fragmentatie ondergaan, maar DNA wordt nog steeds gesplitst wanneer Cellen zijn gefagocytoseerd. Wanneer deze cellen worden gebruikt als apoptotische doelen in een fagocytose-analyse, is alleen het DNA van opgezwakte apoptotische cellen gefragmenteerd en gekleurd door TdT-gemedieerde DUTP nick end labeling (TUNEL). Daarom leve1 van apoptotische celvergisting wordt gemeten door TUNEL signalen in een mengsel van fagocyten en apoptotische cellen 13 te tellen.
In D. melanogaster zijn professionele fagocyten genaamd hemocyten, Drosophila macrofagen, verantwoordelijk voor de fagocytose van apoptotische cellen 14 , 15 . Naast in vitro phagocytose assays met cultuurcellijnen, zijn in vivo phagocytose assays met hele Drosophila embryo's beschikbaar. Drosophila embryo's zijn een krachtig hulpmiddel om het niveau van apoptotische celvervulling te onderzoeken omdat veel cellen apoptose ondergaan en gefagocytoseerd worden door hemocyten tijdens embryonale ontwikkeling 14 , 15 , 16 . Een voorbeeld van een in vivo fagocytose assay is de methode ontwikkeld door Franc's groep. In hun werkwijze zijn hemocyten deGetekend door het immunostaining van peroxidasine, een hemocytmarkering, worden apoptotische cellen gekleurd met behulp van de nucleaire kleurstof, 7-aminoactinomycine D in hele Drosophila embryo's en het aantal dubbele positieve cellen wordt geteld als een signaal van fagocytose 17 . Een ander voorbeeld van een fagocytose-bepaling op embryo's is gebaseerd op het concept van Nagata's methode die hierboven is beschreven; In vivo wordt fagocytose echter geëvalueerd met behulp van de embryo's van dCAD ( Drosophila caspase-geactiveerde DNase) mutante vliegen 18 , 19 . Deze in vivo fagocytose assays zijn bruikbaar voor het direct observeren van fagocytose in situ . Echter, problemen zijn geassocieerd met het uitsluiten van eventuele vooroordeel in de stap van het telgen van fagocytosecellen omdat het moeilijk is om alle fagocyten en apoptotische cellen in volledige embryo's te observeren vanwege de dikte ervan.
Om deze beperking te overwinnen ontwikkelen wijEen nieuwe fagocytose-analyse in Drosophila embryo's uitgegeven. In onze werkwijze, om gemakkelijk fagocytoserende hemocyten te tellen, worden gehele embryo's gehomogeniseerd om verspreide embryonale cellen te bereiden. Fagocyten worden gedetecteerd door het immunostaining van een fagocyt markering, en apoptotische cellen worden gedetecteerd door TUNEL met deze gedispergeerde embryonale cellen. Het gebruik van gedispergeerde embryonale cellen stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus te meten alsof we een in vitro fagocytose-analyse uitvoeren die precies het niveau van fagocytose kwantificeert. Alle genotypes van vliegen kunnen in deze test worden gebruikt als ze zich ontwikkelen tot stadium 16 van embryo's 20 , de ontwikkelingsfase waarbij apoptotische celklaring door fagocytose het meest voorkomend is. Deze werkwijze heeft het voordeel om het niveau van fagocytose kwantitatief te beoordelen en kan derhalve bijdragen aan de identificatie van nieuwe moleculen die betrokken zijn bij de fagocytose van apoptotische cellen in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij hebben hierin een fagocytose-bepaling beschreven met behulp van Drosophila embryo's. Door gebruik te maken van gedispergeerde embryonale cellen om kwagocytose te kwantitatief te meten, zijn hemocyten, professionele profiocyten van Drosophila immunostained voor de hemocytmarker Croquemort of srpHemo- gedreven GFP, en in dit protocol worden apoptotische cellen gedetecteerd door TUNEL. Het niveau van fagocytose wordt uitgedrukt als een fagocytische index door het totale aantal hemoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Kaz Nagaosa en Akiko Shiratsuchi voor hun advies.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116 (2), 205-219 (2004).
- Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96 (2), 245-254 (1999).
- Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).
- Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).
- Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).
- Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).
- Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
- Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).
- Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).
- Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107 (1), 27-41 (2001).
- Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).
- Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
- Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117 (1), 29-43 (1993).
- Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).
- Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).
- Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).
- Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).
- Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).
- Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).
- Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).
- Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).
- Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).
- Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).
- Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).
