에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em> Drosophila</em> 태아
Summary
우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.
Abstract
세포 사멸 세포의 탐식 작용을하는 분자 기작은 면역 및 염증성 난치병에서의 역할 때문에 더 자세하게 밝혀야한다. 우리는 여기에 과일 파리 Drosophila를 사용하여 정량적으로 식균 작용을 조사하는 실험적 방법을 개발했다.이 방법은 삼투 반응을 조절하는 유전자 네트워크가 포유 동물로부터 진화 적으로 보존되어있다. 전체 동물을 사용하여 삼투 및 삼투 식각 세포를 정확하게 검출하고 계산하기 위해 Drosophila 배아를 균질화하여 식균 및 아폽토시스 세포를 포함한 분산 된 세포를 얻었다. 분산 된 배아 세포의 사용은 마치 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하고 식균 작용의 수준을 정량화 할 수 있는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. 이 방법이 이전 연구의 결과를 재현한다는 것을 확인했습니다.apoptotic 세포의 phagocytosis에 필요한 유전자를 확인했다. 이 방법은 죽은 세포의 삼투를 분석하고, 강력한 유전학 인 Drosophila 와 결합하면 식세포에 의한 세포 사멸 (apoptotic) 세포의 이동, 인식, 삼투 및 분해로 구성된 복잡한 식균 반응을 나타냅니다.
Introduction
예를 들어 선충류 Caenorhabditis elegans , 초파리 Drosophila melanogaster 및 생쥐와 인간과 같은 전이 동물의 경우 많은 수의 세포가 발달 중에 체내를 형성하고 성인기에 항상성을 유지하기 위해 세포 사멸을 경험합니다 1 , 2 . 세포 사멸 세포는 완전히 제거되지 않으면 면역 원성 세포 내 물질을 방출하여 주변 조직에 염증을 유도하기 때문에 신속하게 제거해야합니다 3 . 신속한 제거를 촉진하기 위해 세포 사멸 세포는 식세포의 삼투 수용체에 의해 인식되고 식균 작용에 의해 제거되는 소위 먹기름 신호를 나타냅니다 3 , 4 , 5 , 6 . 따라서, 식균 작용은 숙주 항상성의 유지에 결정적인 역할을하므로, apoptotic 세포의 phagocytosis의 밑에 lar 기계 장치는 중요하다.
세포 사멸 세포의 식균 작용을 담당하는 메커니즘은 진화 적 선충, 초파리, 생쥐 7 종에 보존 한 것으로 나타났습니다. 여러 가지 식균 작용 분석법이 현재이 모델 동물에서 사멸 세포의 웅덩이를 평가하기 위해 이용 가능하다. C. 엘레 간스 에서 131 체세포는 발달 중에 프로그램 된 세포 사멸을 겪고 세포 시체는 비 전문적인 식세포 8 인 이웃 세포에 의해 탐식된다. 따라서, C. elegans 의 잔류 세포 시체 수를 세는 것은 생체 내에서 의 식균 작용의 정도를 나타낸다 . 증가 된 사멸 세포 수를 나타내는 선충 돌연변이를 탐색함으로써, 식균 작용에 필요한 여러 유전자가 동정되었고 유전 학적으로 9 , 10 ,s = "xref"> 11 , 12 .
일차 배양 식세포, 일반적으로 대 식세포를 사용한 생체 외 탐식 작용은 마우스에서 종종 이용된다. 아폽토시스 (apoptotic) 세포는 Jurkat 세포와 같은 세포주를 사용하여 준비되며 1 차 식균과 혼합됩니다. 수 시간 동안 배양 한 후, 식균 작용의 수준을 평가하기 위해 식세포와 삼투 식세포의 총 수를 세었다. 이 방법을 정교하게 변형시킨 Nagata의 연구팀은 apoptotic cell이 apoptotic DNA 단편화를 일으키지 않고 caspase-resistant ICAD (caspase-activated DNase의 억제제)를 발현하는 세포를 이용한 ex vivo 식균 작용 분석을 개발했다. 세포는 식균된다. 이러한 세포가 식균 작용 분석에서 세포 사멸 목표로 사용될 때, 삼투 된 세포 사멸 세포의 DNA 만 단편화되고 TdT 매개 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)에 의해 염색된다. 따라서,사멸 세포의 말림 (L)는 식세포 사멸 세포 및 13의 혼합물 TUNEL 신호를 카운트함으로써 측정된다.
D. melanogaster에서 , hemocytes, Drosophila macrophages라는 전문 식세포가 세포 사멸 세포의 탐식 작용을 담당합니다 14 , 15 . 배양 세포주를 이용한 in vitro phagocytosis assay 에 더하여, 전체 Drosophila 배아를 이용한 in vivo phagocytosis assay가 가능합니다. 초파리 배아는 많은 세포가 사멸을 받아야하고 배아 발달 14, 15, 16시 혈구에 의해 포식하기 때문에 세포 사멸 세포 말림의 수준을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 생체 내 식균 작용의 예는 프랑 그룹이 개발 한 방법입니다. 그들의 방법에서는, hemocytes는이다 deperoxidasin, 혈구 마커의 면역 염색에 의해 tected, 사멸 세포는 핵 염색 전체 초파리 배아 티노 마이신 D (7) 아미노산을 이용하여 염색하고, 이중 양성 세포의 수는 탐식 (17)의 신호로 간주된다. 배아에 대한 식균 작용 분석의 또 다른 예는 위에 기술 된 Nagata의 방법의 개념에 기초한다. 그러나, 생체 내 식균 작용은 dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) 돌연변이 파리 18 , 19 의 배아를 사용하여 평가됩니다. 이러한 in vivo phagocytosis assay는 in situ에서 phagocytosis를 직접 관찰하는데 유용합니다. 그러나, 어려움은 식균 세포를 계수하는 단계에서 가능한 모든 편향을 배제하는 것과 관련이 있는데, 그 이유는 그것의 두께로 인해 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하기가 어렵 기 때문이다.
이 한계를 극복하기 위해 우리는Drosophila 배아에서 새로운 식균 작용을 분석했다. 우리의 방법에서는 식균 가능한 혈구를 쉽게 계산하기 위해 전체 배아를 균질화하여 분산 된 배아 세포를 준비한다. 식세포는 식세포 마커의 면역 염색에 의해 검출되며, 아폽토시스 세포는 이들 배아 세포가 분산 된 TUNEL에 의해 검출된다. 분산 된 배아 세포의 사용은 우리가 정확하게 식세포 증의 수준을 정량화하는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. phagocytosis에 의한 세포 사멸 (apoptotic cell clearance)이 가장 많은 발달 단계 인 배아 20의 16 단계로 발전하면 파리의 모든 유전형이이 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 식균 작용의 양을 정량적으로 평가할 수있는 장점이 있어 생체 내 apoptotic 세포의 식균 작용에 관여하는 새로운 분자의 동정에 기여할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 Drosophila 배아를 사용하여 식균 작용 분석을 설명했다. 식균 작용을 정량적으로 측정하기 위해 분산 된 배아 세포를 사용함으로써 hemocyte, Drosophila professional phagocytes가 hemocyte marker Croquemort 또는 srpHemo- driven GFP에 대해 면역 염색되고, apoptotic 세포가이 프로토콜에서 TUNEL에 의해 검출됩니다. 식균 작용의 수준은 hemocytes와 phagocytosing hemocytes의 총 수를 세어 phagocy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그들의 조언에 대해 Kaz Nagaosa와 Akiko Shiratsuchi에게 감사드립니다.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
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