Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in<em> Drosophila</em> Embrioni
Summary
Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.
Abstract
I meccanismi molecolari alla base della fagocitosi delle cellule apoptotici devono essere chiariti in modo più dettagliato a causa del suo ruolo in malattie intractable e immunitarie e infiammatorie. Noi qui abbiamo sviluppato un metodo sperimentale per studiare la fagocitosi in modo quantitativo utilizzando la mosca Drosophila di frutta, in cui la rete genica che controlla le reazioni di engulfment è evolutamente conservata dai mammiferi. Al fine di rilevare e contare con precisione i fagociti inghiottiti e inattivi con animali interi, gli embrioni di Drosophila sono stati omogeneizzati per ottenere le cellule disperse, compresi i fagociti e le cellule apoptotiche. L'uso di cellule embrionali disperse ci permette di misurare i livelli di fagocitosi in vivo come se avessimo eseguito un test di fagocitosi in vitro in cui è possibile osservare tutti i fagociti e le cellule apoptotiche in embrioni interi e precisamente quantificare il livello di fagocitosi. Abbiamo confermato che questo metodo riproduce quelli di studi precedentiChe ha identificato i geni richiesti per la fagocitosi delle cellule apoptotiche. Questo metodo permette di analizzare l'engulfment di cellule morte e, in combinazione con la potente genetica di Drosophila , rivelerà le complesse reazioni fagocitiche che comprendono la migrazione, il riconoscimento, l'engulfment e il degrado delle cellule apoptotiche mediante fagociti.
Introduction
Negli animali metazoi, ad es. Il nematode Caenorhabditis elegans , la mosca di frutta Drosophila melanogaster , e topi e umani, un gran numero di cellule subiscono apoptosi durante lo sviluppo per modellare i loro corpi e in età adulta per mantenere l'omeostasi 1 , 2 . Le cellule apoptotiche devono essere rapidamente rimosse perché inducono l'infiammazione nei tessuti circostanti liberando materiali intracellulari immunogenici se non completamente rimossi 3 . Al fine di facilitare la rimozione rapida, le cellule apoptotiche presentano i cosiddetti segnali alimentari riconosciuti dai recettori di engagement dei fagociti e vengono eliminati dalla fagocitosi 3 , 4 , 5 , 6 . Pertanto, la fagocitosi svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi ospite e, dunque, illustra la molecola Lar meccanismi alla base della fagocitosi delle cellule apoptotiche è di importanza.
I meccanismi responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotici sembrano evoluzionalmente conservati tra le specie nei nematodi, mosche e topi 7 . Attualmente sono disponibili diversi dosaggi di fagocitosi per valutare l'ingrasso di cellule apoptotiche in questi animali modello. In C. elegans , 131 cellule somatiche subiscono una morte cellulare programmata durante lo sviluppo, ei cadaveri cellulari sono fagocitati dalle cellule vicine, che sono fagociti non professionali 8 . Quindi, contando il numero di restanti cellule di cellule in C. elegans indica il livello di fagocitosi in vivo . Cercando mutanti di nematodi che mostrano un numero crescente di cellule morte, sono stati identificati diversi geni richiesti per la fagocitosi e caratterizzati geneticamente da 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
I campioni di fagocitosi ex vivo con fagociti di coltura primaria, generalmente macrofagi, vengono spesso utilizzati nei topi. Le cellule apoptotiche vengono preparate utilizzando linee cellulari come le cellule Jurkat e sono mescolate con fagociti primari. Dopo un'incubazione per diverse ore, il numero totale di fagociti e fagociti inghiottiti vengono contati per valutare il livello della fagocitosi. Come una sofisticata modifica di questo metodo, il gruppo di Nagata ha sviluppato un test di fagocitosi ex vivo con le cellule che esprimono un ICAD resistente alla caspasi (inibitore della DNasi attivata da caspasi), in cui le cellule apoptotiche non subiscono la frammentazione del DNA apoptotica, ma il DNA è ancora ceduto quando Le cellule sono fagocitose. Quando queste cellule vengono utilizzate come obiettivi apoptotici in un dosaggio di fagocitosi, solo il DNA delle cellule apoptotiche inghiottite viene frammentato e macchiato mediante etichettatura TUTT-mediata di dUTP (TUNEL). Pertanto, la levaL di ingrasso cellulare apoptotico è misurato contando i segnali TUNEL in una miscela di fagociti e di cellule apoptotiche 13 .
In D. melanogaster , fagociti professionali chiamati emociti, macrofagi Drosophila , sono responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotiche 14 , 15 . Oltre ai dosaggi di fagocitosi in vitro con linee di cellule di coltura, sono disponibili test di fagocitosi in vivo con tutti gli embrioni Drosophila . Gli embrioni di Drosophila sono un potente strumento per esaminare il livello di induzione di cellule apoptotiche perché molte cellule subiscono l'apoptosi e sono fagocitate da emociti durante lo sviluppo embrionale 14 , 15 , 16 . Un esempio di un test di fagocitosi in vivo è il metodo sviluppato dal gruppo di Franc. Nel loro metodo, gli emociti sono deTossicodipendente perossidasina, un marker emocitico, le cellule apoptotiche vengono colorate utilizzando il colorante nucleare, 7-amino actinomicina D negli embrioni interi Drosophila e il numero di cellule doppie positive viene contato come segnale di fagocitosi 17 . Un altro esempio di un test di fagocitosi sugli embrioni si basa sul concetto del metodo di Nagata descritto in precedenza; tuttavia, fagocitosi in vivo è valutata utilizzando gli embrioni di DCAD (Drosophila caspasi-attivato DNasi) mutante vola 18, 19. Questi test di fagocitosi in vivo sono utili per osservare direttamente la fagocitosi in situ . Tuttavia, le difficoltà sono associate ad escludere ogni possibile polarizzazione nella fase di conteggio delle cellule fagocitose perché è difficile osservare tutti i fagociti e le cellule apoptotiche in embrioni interi a causa dello spessore.
Al fine di superare questa limitazione, ci sviluppiamoEd un nuovo dosaggio di fagocitosi negli embrioni di Drosophila . Nel nostro metodo, per poter facilmente contare gli emociti fagocitosi, tutti gli embrioni vengono omogeneizzati per preparare cellule embrionali disperse. I fagociti sono rilevati mediante l'immunostaining di un marker di fagocita e le cellule apoptotiche sono rilevate da TUNEL con queste cellule embrionali disperse. L'uso di cellule embrionali disperse ci permette di misurare i livelli di fagocitosi in vivo come se abbiamo effettuato un test di fagocitosi in vitro che precisamente quantifica il livello della fagocitosi. Tutti i genotipi di mosche possono essere impiegati in questo saggio se si sviluppano allo stadio 16 degli embrioni 20 , lo stadio di sviluppo in cui la clearance delle cellule apoptotiche mediante la fagocitosi è la più abbondante. Questo metodo ha il vantaggio di valutare quantitativamente il livello della fagocitosi e, quindi, può contribuire all'identificazione di nuove molecole coinvolte nella fagocitosi delle cellule apoptotiche in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un test di fagocitosi usando embrioni di Drosophila . Utilizzando cellule embrionali disperse per misurare la fagocitosi quantitativamente, gli emociti, i fagociti professionali di Drosophila , sono immunociti per il marker Crohnemort o il GHP driven by SrHemo , e le cellule apoptotiche vengono rilevate da TUNEL in questo protocollo. Il livello di fagocitosi è espresso come indice fagocitico contando il numero totale di emociti e fegocitosi emociti. L'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Kaz Nagaosa e Akiko Shiratsuchi per il loro consiglio.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
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