Fagocytoseanalyse for apoptotiske celler i<em> Drosophila</em> Embryoer

Summary

Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av de dispergerte embryonale celler av Drosophila . Det gjør det mulig for oss å enkelt og nøyaktig kvantifisere fagfaktocytosnivåer in vivo , og å identifisere nye molekyler som kreves for fagocytose av apoptotiske celler.

Abstract

De molekylære mekanismene som ligger til grund for fagocytosen til apoptotiske celler, må bli belyst i større detalj på grunn av sin rolle i immun- og inflammatoriske uopprettelige sykdommer. Her har vi utviklet en eksperimentell metode for å undersøke fagocytose kvantitativt ved bruk av fruktfluen Drosophila , hvor gennettverket som styrer engulferingsreaksjoner, evolusjoneres konservert fra pattedyr. For å nøyaktig oppdage og telle innfylling og unngulfing av fagocytter under anvendelse av hele dyr, ble Drosophila- embryoer homogenisert for å oppnå dispergerte celler, inkludert fagocytter og apoptotiske celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytose-analyse der det er mulig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer og nøyaktig kvantifisere nivået av fagocytose. Vi bekreftet at denne metoden gjengir dem fra tidligere studierSom identifiserte genene som kreves for fagocytose av apoptotiske celler. Denne metoden tillater at engulfering av døde celler analyseres, og når de kombineres med den kraftige genetikken til Drosophila , vil det avsløre de komplekse fagocytiske reaksjoner som består av migrasjon, anerkjennelse, engulfering og nedbrytning av apoptotiske celler av fagocytter.

Introduction

I metazoan dyr, for eksempel nematoden Caenorhabditis elegans , fruktflugten Drosophila melanogaster og mus og mennesker, gjennomgår et stort antall celler apoptose under utvikling for å forme kroppene deres og i voksen alder for å opprettholde homøostasis ^{1 , 2} . Apoptotiske celler må fjernes raskt fordi de induserer betennelse i det omgivende vev ved å frigjøre immunogene intracellulære materialer hvis de ikke er helt fjernet ³ . For å lette rask fjerning presenterer apoptotiske celler såkalte spise-meg-signaler som er anerkjent av engulferingsreceptorene av fagocytter, og elimineres av fagocytose ^{3 , 4 , 5 , 6} . Fagocytose spiller således en avgjørende rolle i opprettholdelsen av vertshemostasen, og dermed utheve molekylen Lar mekanismer som ligger til grunn for fagocytose av apoptotiske celler er av betydning.

Mekanismene som er ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler, synes å være evolusjonelt konserverte blant arter i nematoder, fluer og mus ⁷ . Flere fagocytoseanalyser er for tiden tilgjengelige for å vurdere engulfering av apoptotiske celler i disse modelldyrene. I C. elegans gjennomgår 131 somatiske celler programmert celledød under utvikling, og cellekropper blir fagocytosed av nabo-celler, som er ikke-profesjonelle fagocytter ⁸ . Således teller antall gjenværende cellekropper i C. elegans indikerer nivået av fagocytose in vivo . Ved å lete etter nematode mutanter som viser et økt antall døde celler, har flere gener som kreves for fagocytose blitt identifisert og genetisk karakterisert ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Eks vivo fagocytose-analyser med primære kultur fagocytter, vanligvis makrofager, benyttes ofte i mus. Apoptotiske celler fremstilles ved bruk av cellelinjer som Jurkat-celler, og blandes med primære fagocytter. Etter en inkubasjon i flere timer, teller det totale antall fagocytter og engulfing fagocytter for å vurdere nivået av fagocytose. Som en sofistikert modifikasjon av denne metoden utviklet Nagatas gruppe en eks vivo fagocytose-analyse med celler som uttrykker en caspase-resistent ICAD (inhibitor av kaspas-aktivert DNase), hvor apoptotiske celler ikke gjennomgår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA spaltes fortsatt når Celler er fagocytosed. Når disse cellene blir brukt som apoptotiske mål i en fagocytoseanalyse, fragmenteres kun DNA fra engulferte apoptotiske celler og farves med TdT-mediert DUTP nick end-merking (TUNEL). Derfor lever deL av apoptotisk celleoppfylling måles ved å telle TUNEL-signaler i en blanding av fagocytter og apoptotiske celler ¹³ .

I D. melanogaster er faglige fagocytter som heter hemocytter, Drosophila- makrofager, ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler ^{14 , 15} . I tillegg til in vitro fagocytose-analyser med kulturcellelinjer er in vivo fagocytose-analyser med hele Drosophila- embryoer tilgjengelige. Drosophila- embryoer er et kraftig verktøy for å undersøke nivået av apoptotisk celleoppfylling fordi mange celler gjennomgår apoptose og fagocytteres av hemocytter under embryonisk utvikling ^{14 , 15 , 16} . Et eksempel på en in vivo fagocytoseanalyse er metoden utviklet av Francs gruppe. I deres metode er hemocytter deAntistoffert ved immunostaining av peroksidasin, en hemocytmarkør, blir apoptotiske celler farget ved bruk av det nukleære fargestoffet, 7-aminoaktinomycin D i hele Drosophila- embryoer, og antall doble positive celler teller som et signal av fagocytose ¹⁷ . Et annet eksempel på en fagocytoseanalyse på embryoer er basert på begrepet Nagatas metode beskrevet ovenfor; Imidlertid evalueres fagocytose in vivo ved bruk av embryoene av dCAD ( Drosophila caspase-aktivert DNase) mutantfluer ^{18 , 19} . Disse in vivo fagocytose-analysene er nyttige for direkte å observere fagocytose in situ . Imidlertid er vanskeligheter forbundet med å utelukke eventuell forspenning i trinnet med å telle fagocytoserende celler fordi det er vanskelig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer på grunn av dens tykkelse.

For å overvinne denne begrensningen utvikler viUtgitt en ny fagocytoseanalyse i Drosophila- embryoer. I vår metode, for å enkelt telle fagocytoserende hemocytter, blir hele embryoer homogenisert for å fremstille dispergerte embryonale celler. Fagocytter detekteres ved immunfarging av en fagocytmarkør, og apoptotiske celler påvises av TUNEL med disse dispergerte embryonale celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytoseanalyse som nettopp kvantifiserer nivået av fagocytose. Alle genotyper av fluer kan benyttes i denne analysen hvis de utvikler seg til stadium 16 av embryoer ²⁰ , utviklingsstadiet hvor apoptotisk celleklarering ved fagocytose er den mest omfattende. Denne metoden har fordelen av å vurdere nivået av fagocytose kvantitativt, og kan således bidra til identifisering av nye molekyler involvert i fagocytose av apoptotiske celler in vivo .

Protocol

1. Fremstilling Tilberedning av friske druesaft-agarplater Tilsett 100 ml vann til 4,4 g agar, og oppvarm blandingen i en mikrobølgeovn for å oppløse agar. Tilsett 80 ml frisk druesaft, 5 ml eddiksyre og 5 ml etanol til agaroppløsning. Hell ca 1,5 ml av oppløsningen med en pipette på hver glidelås, og la den størkne. Fremstilling av 6 cm parabolen agaroseplater Tilsett 50 ml vann til 0,5 g agarose, og oppvarm b…

Representative Results

For å undersøke fagocytosen av apoptotiske celler ble Drosophila- embryoer fra utviklingsstadiet 16 oppsamlet og fremstilt som dispergerte celler. Hemocytter, Drosophila- makrofager, ble farget ved immunocytokjemi for hemocytmarkøren "Croquemort" 17 , 22 ved bruk av et spesifikt antistoff 19 , 21 og apoptotiske celler ble farget av TUNEL i d…

Discussion

Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av Drosophila- embryoer. Ved å bruke dispergerte embryonale celler for å måle fagocytose kvantitativt, hemocytter, Drosophila profesjonelle fagocytter, immunostained for hemocytmarkøren Croquemort eller srpHemo- driven GFP, og apoptotiske celler påvises av TUNEL i denne protokollen. Nivået av fagocytose uttrykkes som en fagocytisk indeks ved å telle totalt antall hemocytter og fagocytoserende hemocytter. Bruken av dispergerte embryonale …

Materials

whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Company	Catalog Number	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	–
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	–