Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal
Summary
Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van een eenvoudige, snelle en efficiënte prion amplificatie techniek, de real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) methode.
Abstract
De RT-QuIC techniek is een gevoelige in vitro cel-vrije prion amplificatie assay voornamelijk gebaseerd op de geplaatste misfolding en aggregatie van recombinante prion-eiwit (PrP) substraat prion zaden als sjabloon gebruiken voor de conversie. RT-QuIC is een nieuwe hoog-productie-techniek die analoog aan de real-time polymerasekettingreactie (PCR is). Detectie van amyloïde fibril groei is gebaseerd op de kleurstof Thioflavin T, dat op specifieke interactie met ᵦ vel rijke eiwitten licht. Dus, kan de amyloïde vorming gedetecteerd worden in real-time. Wij probeerden om een betrouwbare, niet-invasieve screeningtest op te sporen van chronische verspillen disease (CWD) prionen in fecale extract. Hier hebben we de RT-QuIC techniek te onthullen PrPSc zaaien activiteit in uitwerpselen van CWD besmet hertachtigen specifiek aangepast. Aanvankelijk was de seeding activiteit van de fecale extracten die wij bereid in RT-QuIC, mogelijk als gevolg van potentiële assay-remmers in het fecaal materiaal relatief laag. Ter verbetering van de activiteit van de seeding van extracten van de ontlasting en verwijderen van potentiële assay-remmers, we de fecale monsters in een buffer met detergenten en proteaseinhibitors gehomogeniseerd. We ook afkomstig van de monsters naar verschillende methodologieën te concentreren PrPSc op basis van eiwit neerslag met behulp van natrium phosphotungstic zuur, en de middelpuntvliedende kracht. Tot slot, de ontlasting extracten zijn getest door geoptimaliseerde RT-QuIC waaronder substraat vervanging in het protocol bij het verbeteren van de gevoeligheid van detectie. Dus, we ingesteld een protocol voor gevoelige detectie van CWD prion activiteit in uitwerpselen van pre-klinische en klinische hertachtigen door RT-QuIC, die een praktisch instrument voor niet-invasieve diagnose van CWD kunnen zaaien.
Introduction
Prionziekten of overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) zijn neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van Creutzfeldt – Jacob (CJD) bij mensen, boviene spongiforme encefalopathie (BSE) bij runderen, scrapie bij schapen en geiten, en chronische verspillen ziekte (CWD) bij hertachtigen 1,2. TSE’s worden gekenmerkt door onderscheidende spongiforme uiterlijk en verlies van neuronen in de hersenen. Volgens de “alleen eiwit” hypothese, zijn prionen voornamelijk samengesteld uit PrPSc (‘Sc’ voor scrapie) 3, een misfolded isovorm van het host-gecodeerde cellulaire prion-eiwit, PrPC. PrPSc vloeit voort uit de omzetting van PrPC in een conformatie verrijkt in ᵦ-bladen 4,5,6 die kan fungeren als een zaadje om te binden en converteren van andere PrPC moleculen. De nieuw gegenereerde PrPSc -moleculen worden opgenomen in een groeiende polymeer 7,8 die in kleinere oligomeren breekt, wat resulteert in hogere nummers van besmettelijke kernen. PrPSc is gevoelig voor aggregatie en is gedeeltelijk resistent tegen proteasen 9,10.
CWD beïnvloedt wilde en gekweekte elanden (Cervus canadensis), muildierhert (Odocoileus hemionus), Witstaarthert (WTD; Odocoileus virginianus), elanden (Alces alces), en (Rangifer dierkunde dierkunde) rendier 11,12,13. Het wordt beschouwd als de meest besmettelijke prionziekte met horizontale overdracht begunstigd door cervid interacties en milieu persistentie van infectiviteit 14,15. In tegenstelling tot andere prionziekten waar PrPSc accumulatie en infectiviteit zijn beperkt tot de hersenen, in CWD zijn deze ook gevonden in perifere weefsels en lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, urine en ontlasting 16,17, 18.
Immunohistochemistry wordt beschouwd als de gouden standaard voor CWD diagnose om PrPSc distributie en spongiforme laesies 19,20te detecteren. ELISA en in meer zeldzame gevallen, westelijke vlek zijn ook gebruikt voor CWD diagnostiek. Huidige prion ziekten diagnose is dus voornamelijk gebaseerd op het opsporen van prionen in post mortem weefsels. Ante mortem diagnose voor CWD is beschikbaar door middel van amandelen of biopsieën recto-anale mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel (RAMALT); echter, deze procedure is invasieve en vereist het vangen van de dieren. Dus, zou het gebruik van gemakkelijk toegankelijke specimens, zoals urine en ontlasting, een praktische manier voor CWD prion detectie. Echter, deze haven uitscheidingsproducten relatief lage concentraties van prionen onder de detectiegrens van huidige diagnostische methoden. Bijgevolg is een gevoeliger en hoge doorvoer diagnostische tool noodzakelijk. In vitro conversie systemen, zoals eiwit misfolding cyclische amplificatie assay (PMCA) 21, amyloid seeding assay, en real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) assay 22,23, 24 zijn zeer krachtige hulpmiddelen te exploiteren de zelf teeltmateriaal vermogen van PrPSc na te bootsen in vitro het prion-conversieproces en daardoor het versterken van de aanwezigheid van minieme hoeveelheden van PrPSc naar detecteerbare niveaus 25 ,26. De RT-QuIC methode, maar profiteert van het feit dat het product van de conversie verrijkt met β-sheet secundaire structuur specifiek thioflavin T (Th-T) kunt binden. Daarom groeit recombinante PrP (rPrP) bij de geplaatste conversie uit tot amyloïde fibrillen die Th-T binden en dus in real time kunnen worden gedetecteerd door het meten van de fluorescentie van Th-T uitgedrukt als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) na verloop van tijd. Zodra gecontroleerd, kan de RFU worden gebruikt om te evalueren van de relatieve seeding activiteiten en kwantitatieve parameters zoals de lag-fase. De lag-fase vertegenwoordigt de (h) benodigde tijd voor het bereiken van de drempel, tijdens welke rPrP conversie in het vroege stadium van de reactie onder de detectiegrens van Th-T fluorescentie is. Het einde van de fase van de schijnbare lag, gelijktijdige tot de vorming van een voldoende amyloïde nucleus (nucleatie/rek), vindt plaats wanneer de Th-T fluorescentie groter is dan de drempelwaarde en positief. De groei van amyloid fibrillen kunnen worden opgespoord in real time en de eerste PrPSc of seeding activiteit opgenomen in de steekproef wordt versterkt door de segmentatie die meer zaden genereert. Deze zaden induceren op zijn beurt een snelle exponentiële groeifase amyloïde vezel.
Omdat deze test is het kundig voor speurder zo laag als 1 fg van PrPSc 24, de hoge gevoeligheid kwalificeert deze techniek om antemortem- of niet-invasieve diagnose door het detecteren van PrPSc in de verschillende perifere weefsels, uitscheidingsproducten of andere soorten specimen lage niveaus van infectiviteit herbergen. RT-QuIC biedt zeker voordelen ten opzichte van andere testen voor de reproduceerbaarheid, bruikbaarheid, snelheid (minder dan 50 h) en lage kosten in vergelijking met bioassays. Het vermijdt de technische complexiteit zoals ultrasoonapparaat gebruikt in PMCA; het wordt ook uitgevoerd in een tape-verzegeld microplate die het risico van aërosol besmetting van elk putje minimaliseert. De multi goed indeling maakt het mogelijk de analyse van maximaal 96 monsters in hetzelfde experiment. Om het steeds terugkerende probleem van valse positieven en spontane omzetting van rPrP in de conversie in vitro testen tegen te gaan is de uitvoering van een drempel (cut-off) in RT-QuIC erg handig. Inderdaad, op basis van de resultaten van de negatieve controle (gemiddelde RFU van negatieve monsters + 5 SD 27), een basislijn wordt ingesteld waarmee discriminatie tussen de positieve en negatieve monsters kan worden gedaan. Het gebruik van vier replicatieonderzoeken voor elk monster kan dus helpen om een monster positief wanneer ten minste 50% van de duplo’s een positief signaal tonen, dat wil zeggen over de licht-donkerscheiding 28. De homologie tussen zaad en substraat is niet vereist in RT-QuIC, zoals bijvoorbeeld in een eerdere studie, hamster rPrP bleek te zijn een gevoeliger substraat in vergelijking met het homologe substraat in menselijke PrPvCJD zaadjes en schapen scrapie agarvoedingsbodem reacties 29. hamster-schapen chimeer rPrP werd ook voorgesteld als een meer geschikt substraat dan menselijke rPrP te sporen van menselijke variant Creutzfeldt-Jakob prionen 30. Dus, het gebruik van rPrP substraten uit verschillende soorten is heel gebruikelijk in deze test. Deze bepaling is met succes toegepast op verschillende prionziekten, zoals de sporadische CJD 31,32,33, geneTIC prion ziekten 34,36,37van de 35,van de BSE- en scrapie 23,36CWD 38,39,40,41, 42. Studies met verwerkt cerebrospinale vloeistof, bloed, speeksel en urine zoals zaden in RT-QuIC allen succesvol waren te detecteren PrPSc 38,39,40,41, 42. ter bevordering van de detectie mogelijkheid in monsters zoals bloedplasma die remmers van amyloïde formatie bevatten kan, Orrú et al. (2011) een strategie om te verwijderen van potentiële remmers van amyloïde vorming door te kammen PrPSc immunoprecipitation (IP) stap en RT-QuIC ontwikkeld, genaamd “versterkte QuIC” assay (eQuIC). Daarnaast een substraat vervanging stap werkte na ~ 24 h van reactietijd ter verbetering van de gevoeligheid. Uiteindelijk, als laag als 1 ag voor PrPSc was aantoonbaar met eQuIC 30.
Fecale monsters verzameld in preklinische en klinische stadia van elk na experimentele mondelinge infectie waren te zuiveren van extracten van de ontlasting mogelijk assay remmers verwijderen in ontlasting, gehomogeniseerd in buffer met detergenten en proteaseinhibitors. De ontlasting-extracten werden verder ingediend bij verschillende methodologieën te concentreren PrPSc in de monsters met behulp van eiwit neerslag via natrium phosphotungstic zuur (NaPTA) neerslag. De neerslag van de NaPTA methode, voor het eerst beschreven door Safar et al. 43, wordt gebruikt om zich te concentreren PrPSc van analysemonsters. De incubatie van NaPTA met de resultaten van de steekproef in preferentiële neerslag van PrPSc in plaats van PrPC. Het moleculaire mechanisme is echter nog onduidelijk. Deze stap heeft ook geholpen dat bevat en het voorkomen van de spontane omzetting van rPrP, die in sommige gevallen wordt waargenomen. Tot slot, de ontlasting extracten zijn getest door geoptimaliseerde RT-QuIC met behulp van de muis rPrP (aa 23-231) als substraat en met inbegrip van basismateriaal vervanging in het protocol ter verbetering van de gevoeligheid van detectie.
De resultaten hier laten zien dat deze verbeterde methode zeer lage concentraties van CWD prionen detecteren kan en de gevoeligheid van de detectie- en specificiteit in fecale monsters in vergelijking met een protocol zonder neerslag en substraat vervanging van de NaPTA verhoogt. Deze methode kan worden toegepast op andere weefsels en lichaamsvloeistoffen potentieel en kan van groot nut zijn voor toezicht op CWD bij hertachtigen wild en in gevangenschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
RT-QuIC was eerder werkzaam voor de opsporing van CWD prionen in urine en fecale extracten van mondeling besmette Witstaarthert en Muildierhert 38. Het systeem dat is afgebeeld in dit manuscript is een aangepaste methode van de RT-QuIC assay. Extra stappen werden ingelijfd bij de “klassieke” RT-QuIC assay de detectie en de gevoeligheid van de test voor CWD prionen in fecaal materiaal van besmette dieren te verbeteren.
De lage gevoeligheid voor detection in ontlasting ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan Dr Byron Caughey (NIH Rocky Mountain laboratoria) voor het verstrekken van opleiding en het cervid PrP bacteriële expressie plasmide. SG wordt ondersteund door het programma van de Canada Research Chair. Wij erkennen dat financiering voor dit onderzoek met SG van genoom Canada, Alberta Prion Research Institute en Alberta land- en bosbouw door genoom Alberta, en de Universiteit van Calgary ter ondersteuning van dit werk. Wij erkennen een onderzoeksbeurs van de Margaret Gunn Foundation for Animal Research.
Materials
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
- Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
- Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
- Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
- Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
- Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
- Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
- Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
- Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
- Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
- Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
- Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
- Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
- Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
- Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
- Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
- Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
- Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
- Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
- Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
- Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
- Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
- Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
- Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
- John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
- Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
- Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
- Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
- Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
- Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
- Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
- Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
- Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
- Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
- Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
- Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
- Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
