एसोसिएटेड वायरल और सेलुलर प्रोटीन की पहचान के लिए वायरल डीएनए का शुद्धिकरण
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विशेष रूप से टैग और चुनिंदा वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए संक्रमित कोशिकाओं से वायरल डीएनए को अलग करने के लिए है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी-1) डीएनए संक्रमित कोशिकाओं से जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जुड़े वायरल और सेलुलर प्रोटीन की पहचान के लिए अलग करने के लिए । हालांकि प्रोटीन है कि वायरल जीनोम के साथ बातचीत संक्रमण के परिणाम के निर्धारण में प्रमुख भूमिका निभाते हैं, वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन का एक व्यापक विश्लेषण पहले संभव नहीं था । यहाँ हम एक विधि है कि संक्रमित कोशिकाओं से एचएसवी-1 जीनोम के प्रत्यक्ष शुद्धि सक्षम बनाता है प्रदर्शन । नकल वायरल डीएनए चुनिंदा संशोधित न्यूक्लियोटाइड है कि एक alkyne कार्यात्मक समूह में शामिल है के साथ लेबल है । लेबल डीएनए तो विशेष रूप से है और अचल एक तांबे के माध्यम से बायोटिन azide के आबंध लगाव के माध्यम से टैग (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition या प्रतिक्रिया क्लिक करें । बायोटिन-टैग डीएनए streptavidin-लेपित मोतियों पर शुद्ध है और जुड़े प्रोटीन eluted और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं । इस विधि चयनात्मक लक्ष्यीकरण और अलगाव एचएसवी-1 प्रतिकृति कांटे या पूरे जीनोम जटिल जैविक वातावरण से सक्षम बनाता है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण के अनुकूलन herpesviral संक्रमण के विभिंन पहलुओं की जांच के लिए अनुमति देगा, साथ ही साथ अंय डीएनए वायरस के जीनोम की परीक्षा ।
Introduction
वायरस एक सीमित क्षमता के लिए आवश्यक कार्य बाहर ले जाने और इसलिए वायरल जीन अभिव्यक्ति, प्रतिकृति, मरंमत, पुनर्संयोजन, और परिवहन सहित संक्रमण के महत्वपूर्ण पहलुओं की सुविधा के लिए मेजबान कारकों पर निर्भर है । इन मेजबान कारकों की गतिविधियों अक्सर वायरल इनकोडिंग प्रोटीन द्वारा संवर्धित कर रहे हैं । इसके अलावा, वायरस पता लगाने और वायरल संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं द्वारा हस्तक्षेप से बचना चाहिए । इसलिए, वायरस मेजबान बातचीत संक्रमण के परिणाम हुक्म । सर्वोपरि महत्व की समझ कैसे वायरस सेलुलर मशीनरी को वायरल प्रक्रियाओं की सुविधा के लिए अनुकूलित करने के लिए सेल्यूलर पर्यावरण को बदल । विशेष रूप से ब्याज की पहचान है जो कारकों और प्रक्रियाओं संक्रामक चक्र में वायरल जीनोम पर कार्रवाई ।
दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1 (एचएसवी-1) एक डबल फंसे डीएनए वायरस है कि मानव आबादी का एक बड़ा अनुपात संक्रमित है । संक्रमण के पहले घंटे के भीतर, वायरल जीनोम नाभिक में प्रवेश करती है, जहां वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक आदेश दिया झरना वायरल डीएनए (vDNA) प्रतिकृति के साथ समंवय में मग्न1। नाभिक में, जीनोम epigenetic विनियमन के अधीन हैं, मरंमत और पुनर्संयोजन से गुजरना, और capsids में पैक कर रहे हैं, ऐसी है कि पहली संतान virions से कम छह घंटे के भीतर उत्पादन कर रहे हैं । संक्रमण के पाठ्यक्रम में वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन के व्यापक मूल्यांकन नींव रखना करने के लिए प्रक्रियाओं के आणविक विवरण की जांच करेगा कि वायरल जीनोम पर अधिनियम, और अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जिसमें वायरल और सेलुलर कारकों संक्रमण के विभिन्न चरणों में शामिल हैं ।
वायरल संक्रमण में शामिल मेजबान कारकों की जांच के लिए पिछले तरीकों एसोसिएटेड सेलुलर प्रोटीन के विश्लेषण के लिए वायरल प्रोटीन का अपनत्व शुद्धिकरण शामिल है2,3,4,5 , ६ , 7 , 8 , 9. ये परख मेजबान एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं में शामिल सेलुलर कारकों की पहचान, साथ ही वायरल क्रोमेटिन संशोधन, जीन अभिव्यक्ति, और डीएनए की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । हालांकि, यह पता लगाना मुश्किल है कि बातचीत vDNA के साथ सहयोग पर निर्भर करता है, और प्रोटियोमिक् केवल बातचीत है कि एक विशिष्ट वायरल कारक के एक समारोह के रूप में होने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जहां विशिष्ट वायरल और सेलुलर प्रोटीन वायरल जीनोम को बांध10,11,12,13,14 , 15 और immunocytochemistry के साथ संयुक्त सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट सेलुलर कारकों के दृश्य सक्षम है कि vDNA के साथ colocalize16,17,18, 19 , 20. इन परख स्थानिक और लौकिक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, सीमाएं अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी, सीमित संवेदनशीलता, और वायरस मेजबान बातचीत में पिछले अंतर्दृष्टि के लिए की जरूरत के लिए की जरूरत है शामिल हैं । इसलिए हम एक iPOND पर आधारित विधि विकसित (नवजात डीएनए पर प्रोटीन का अलगाव)21 और aniPOND (त्वरित देशी iPOND)22 चुनिंदा लेबल और वायरल जीनोम की निष्पक्ष पहचान के लिए संक्रमित कोशिकाओं से vDNA को शुद्ध जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संबद्ध प्रोटीन । iPOND सेलुलर प्रतिकृति कांटा गतिशीलता की जांच के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
संक्रमित कोशिकाओं से वायरल जीनोम के चयनात्मक शुद्धिकरण के लिए, नकल vDNA ethynyl संशोधित nucleosides, 5-ethynyl-2 ´-deoxyuridine (EdU) या 5-ethynyl-2 ´-deoxycytidine (EdC) के साथ लेबल किया गया है (चित्रा 1), आबंध द्वारा पीछा विकार पर क्लिक करें रसायन विज्ञान के माध्यम से बायोटिन azide के लिए वायरल जीनोम के एकल कदम शुद्धिकरण और streptavidin-लेपित मोतियों पर जुड़े प्रोटीन की सुविधा (चित्रा बीसी) । महत्वपूर्ण बात, संक्रमण स्थिर कोशिकाओं में किया जाता है, जो सेलुलर डीएनए प्रतिकृति में vDNA के विशिष्ट लेबलिंग सक्षम करने के लिए नहीं लगे हैं । इसके अलावा, एचएसवी-1 संक्रमण कोशिका चक्र गिरफ्तारी का कारण बनता है और सेलुलर डीएनए प्रतिकृति23,24को रोकता है । वायरस आने वाले वायरल जीनोम (चित्र 1a) या नव संश्लेषित vDNA (चित्र 1bके साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए डीएनए प्रतिकृति के दौरान लेबल के साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए संक्रमण से पहले लेबल किया जा सकता है) 25. इसके अलावा, पल्स चेस विश्लेषण वायरल प्रतिकृति कांटे (चित्रा 1C)26के साथ जुड़े प्रोटीन की प्रकृति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, ethynyl संशोधित vDNA प्रोटीन गतिशीलता (चित्रा 2a और चित्रा 3) के स्थानिक जांच के लिए एक fluorophore के लिए संयुग्मित covalently किया जा सकता है । इमेजिंग vDNA के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है और vDNA-प्रोटीन बातचीत के सत्यापन के लिए एक मानार्थ दृष्टिकोण है, और संक्रमण भर में वायरल जीनोम ट्रैक अनुकूलित किया जा सकता है । हमें आशा है कि इन दृष्टिकोण और herpesviral संक्रमण के किसी भी पहलू का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, विलंबता और पुनर्सक्रियण सहित, और अंय डीएनए वायरस का अध्ययन । इसके अलावा, 5-ethynyl uridine (ईयू) के साथ लेबलिंग आरएनए वायरल जीनोम के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है ।
Protocol
1. सेल कल्चर, वायरल इंफेक्शन, और EdC लेबलिंग ( आरेख 1 )
निंन प्रोटोकॉल में वायरस के साथ कार्य करना शामिल है । वायरस और अन्य जैविक एजेंटों के सुरक्षित हैंडलिंग के संबंध में कृप?…
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल कई कदम है जो, अगर ध्यान से पीछा नहीं, काफी कम प्रोटीन उपज या सेलुलर डीएनए के साथ संदूषण में परिणाम कर सकते है शामिल हैं । यह महत्वपूर्ण है कि स्थिर कोशिकाओं सभी प्रयोगों के लिए सुनिश्चित करे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि की तैयारी में मदद के लिए हंना फॉक्स स्वीकार करते हैं । इस काम को NIH ग्रांट R01AI030612 ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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