Purification de l’ADN Viral pour l’Identification des protéines virus et cellulaires associées

Summary

Le but du présent protocole est de marquer spécifiquement et sélectivement isoler l’ADN virale des cellules infectées pour la caractérisation des protéines de génome viral lié.

Abstract

Le but du présent protocole est d’isoler le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) ADN provenant de cellules infectées pour l’identification des associés virale et cellulaires protéines par spectrométrie de masse. Bien que les protéines qui interagissent avec les génomes viraux jouent un rôle important en déterminant les résultats de l’infection, une analyse complète des protéines de génome viral lié n’était pas précédemment possible. Nous démontrons une méthode qui permet la purification directe de HSV-1 génomes de cellules infectées. Réplication de l’ADN viral est sélectivement marquée avec des nucléotides modifiés contenant un groupe fonctionnel d’alcyne. DNA marqué est ensuite plus précisément et de manière irréversible tag via la fixation covalente d’azoture de biotine par l’intermédiaire de cuivre (I)-réaction de cycloaddition ou clic azoture-alcyne catalysée par. Biotine-tag ADN est purifiée sur perles streptavidine et protéines associées sont éluées et identifiés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet le ciblage sélectif et l’isolement des fourches de réplication de HSV-1 ou des génomes entiers de milieux biologiques complexes. Par ailleurs, l’adaptation de cette approche permettra d’enquête sur les divers aspects de l’infection baculoviraux, ainsi que l’examen des génomes d’autres virus à ADN.

Introduction

Les virus ont une capacité limitée à remplir les fonctions essentielles et dépendent donc de facteurs de l’hôte pour faciliter les aspects critiques de l’infection, y compris le transport, la réplication, réparation, recombinaison et expression des gènes viraux. Les activités de ces facteurs de l’hôte sont souvent complétées par protéines virale. En outre, virus doivent éviter de détection et brouillage de la réponse cellulaire à l’infection virale. Par conséquent, interactions hôte virus dictent l’issue de l’infection. D’une importance primordiale est de comprendre comment les virus modifient l’environnement cellulaire afin d’adapter la machinerie cellulaire pour faciliter les processus viraux. Particulièrement intéressant est d’identifier quels facteurs et processus, agissent sur les génomes viraux durant tout le cycle infectieux.

Le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) est qu’un double stranded DNA virus qui infecte une proportion importante de la population humaine. Dans la première heure de l’infection, le génome viral pénètre dans le noyau, où une cascade ordonnée de l’expression des gènes viraux s’ensuit en coordination avec virale de réplication de l’ADN (vDNA)¹. Dans le noyau, génomes sont soumis à régulation épigénétique, subir une réparation et recombinaison et sont emballés dans des capsides, telle que les virions de descendance premiers sont produites au sein de moins de six heures. L’évaluation complète des protéines de génome viral associé tout au long de l’évolution de l’infection jettera les bases pour étudier les détails moléculaires des processus qui agissent sur les génomes viraux et permettent de mieux comprendre quels facteurs viraux et cellulaires participent à divers stades de l’infection.

Les méthodes précédentes pour l’étude des facteurs impliqués dans l’infection virale de l’hôte incluent purification d’affinité des protéines virales pour l’analyse des protéines cellulaires associées^{2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9}. ces tests ont joué pour l’identification des facteurs cellulaires impliqués dans les réponses antivirales de l’hôte, mais aussi modification de la chromatine virale, l’expression des gènes, et réparation de l’ADN. Toutefois, il est difficile de vérifier si les interactions dépendent de la liaison avec vDNA, et protéomique seulement permettent de mieux comprendre les interactions qui se produisent en fonction d’un facteur viral spécifique. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été utilisée pour identifier où les protéines virus et cellulaires spécifiques se lient à des génomes viraux^{10,11,12,13,14 , 15} et hybridation in situ fluorescente (FISH) combinée à l’immunocytochimie a permis la visualisation des facteurs cellulaires qui sont colocalisées avec vDNA^{16,17,18, 19 , 20}. ces tests permettent une analyse spatiale et temporelle. Cependant, les limitations incluent la nécessité d’anticorps hautement spécifiques, sensibilité limitée et la nécessité pour le précédent aperçu interactions hôte virus. Nous avons donc mis au point une méthode basée sur iPOND (isolement des protéines sur l’ADN naissante)²¹ et aniPOND (iPOND native accélérée)²² à étiqueter de manière sélective et purifier vDNA de cellules pour l’identification non biaisée du génome viral infectées protéines associées par spectrométrie de masse. iPOND a joué un rôle déterminant pour l’investigation de la fourche de réplication cellulaire dynamique.

Pour l’épuration sélective des génomes viraux provenant de cellules infectées, reproduisant vDNA est étiqueté avec éthynyl modifiée nucléosides, 5-éthynyl-2´-déoxyuridine (EdU) ou 5-éthynyl-2´-désoxycytidine (EdC) (Figure 1), suivie par liaisons covalentes conjugaison de l’azoture de biotine par clic chimie pour faciliter la purification de la seule étape de génomes viraux et des protéines associées sur streptavidine perles (Figure 2 b). Ce qui est important, les infections sont réalisées dans des cellules fixes qui ne sont pas engagés dans la réplication de l’ADN cellulaire pour permettre un étiquetage spécifique de vDNA. En outre, infection par HSV-1 provoque l’arrêt du cycle cellulaire et inhibe la cellular DNA réplication^23,24. Virus peut être prémarquées avant l’infection pour l’analyse des protéines associées aux génomes viraux entrants (Figure 1 a) ou marqués au cours de la réplication de l’ADN pour l’analyse de protéines nouvellement synthétisée vDNA (Figure 1 b) ²⁵. en outre, pulse chase analyse peut être utilisée pour étudier la nature des protéines associées à la réplication virale fourches (Figure 1)²⁶. En outre, éthynyl-modified vDNA peut être conjugué de façon covalente à un fluorophore pour l’exploration spatiale de la dynamique des protéines (Figure 2 et Figure 3). L’imagerie permet la visualisation directe de vDNA et est une approche gratuite pour la validation des interactions protéine-vDNA peut être adapté pour assurer le suivi des génomes viraux tout au long de l’infection. Nous prévoyons que ces approches pourraient être modifiées ultérieurement pour étudier n’importe quel aspect d’infection baculoviraux, y compris le temps de latence et de réactivation et d’étudier d’autres virus à ADN. En outre, marquage avec l’uridine 5-éthynyle (UE) pourrait permettre pour l’analyse des génomes viraux RNA.

Protocol

1. Culture cellulaire, Infection virale et EdC Labeling ( Figure 1) le protocole suivant implique l’utilisation de virus. Veuillez vous référer à votre établissement ' protocoles de biosécurité s concernant la manipulation sécuritaire des virus et autres agents biologiques. Ce protocole a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle de l’Université de Pittsburgh. Trypsinize une fiole de vitroplants confluentes 150 cm …

Representative Results

Tout d’abord, l’utilisation de la chimie de clic pour la purification de l’ADN des cellules a été réalisée par la méthode d’iPOND21. Le but d’iPOND est de purifier les fourches de réplication cellulaire pour l’identification des protéines associées. Nous avons adapté cette technique afin d’étudier spécifiquement les interactions de protéine de vDNA au cours de l’infection. Manipulation de l’approche d’étiqueter des génomes viraux a…

Discussion

Ce protocole comprend plusieurs étapes qui, si ne pas suivi attentivement, peuvent entraîner en rendement de protéine significativement réduite ou une contamination par l’ADN cellulaire. Il est essentiel que cellules stationnaires sont utilisés pour toutes les expériences à faire en sorte que l’ADN cellulaire n’est pas étiqueté et purifié. Ceci peut être confirmé par l’absence de polymérases d’ADN cellulaires dans l’échantillon de protéines car HSV1 n’utilise pas l’ADN polymérase cellulaire …

Materials

MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer			prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2X Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C