تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.

Introduction

فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.

فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج تقطعت الحمض النووي الفيروس الذي يصيب نسبة كبيرة من السكان. خلال الساعة الأولى من الإصابة، يدخل الجينوم الفيروسي النواة، حيث تستتبعه تتالي أمر التعبير المورثات الفيروسية في التنسيق مع النسخ المتماثل (فدنا) من الحمض النووي الفيروسي¹. في النواة، جينومات تخضع لضوابط تنظيمية جينية والخضوع لإصلاح واقترانها، ويتم تعبئتها في كابسيدس، حيث يتم إنتاج فيريونس ذرية الأولى خلال أقل من ست ساعات. التقييم الشامل للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة طوال فترة الإصابة سترسي الأساس للتحقيق في تفاصيل العمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي، وسوف توفر نظرة ثاقبة العوامل الفيروسية والخلوية التي الجزيئية يشاركون في مراحل مختلفة من العدوى.

وتشمل الأساليب السابقة لتحقيق العوامل المضيفة المعنية في العدوى الفيروسية تقارب تنقية البروتينات الفيروسية لتحليل البروتينات الخلوية المرتبطة بها^2،3،،من^{45 , 6 , 7 , 8 , 9}-هذه الاختبارات كانت مفيدة للتعرف على العوامل الخلوية التي ينطوي عليها في الردود المضادة للفيروسات المضيفة، فضلا عن تعديل الكروماتين الفيروسية، والتعبير الجيني، وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك، من الصعب التأكد من ما إذا كانت التفاعلات تعتمد على الرابطة مع فدنا، والبروتيوميات فقط توفير نظرة ثاقبة التفاعلات التي تحدث كدالة لعامل فيروسية معينة. وقد استخدمت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) لتحديد حيث ربط محددة من البروتينات الفيروسية والخلوية للجينوم الفيروسي^10،،من^1112،،من^{1314 , 15} والتهجين في الموقع نيون (الأسماك) جنبا إلى جنب مع إيمونوسيتوتشيميستري وقد مكن تصور العوامل الخلوية التي كولوكاليزي مع^، فدنا^16،،من^{1718 19 , 20}-تتيح هذه الاختبارات للتحليل المكاني والزماني. ومع ذلك، تشمل القيود الحاجة إلى أجسام مضادة محددة للغاية، وحساسية محدودة، والحاجة إلى ثاقبة الفيروس المضيف التفاعلات السابقة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب يقوم على إيبوند (عزل البروتينات على الحمض النووي الوليدة)²¹ والمصابين أنيبوند (إيبوند الأصلية المعجل)²² للتسمية بشكل انتقائي وتنقية فدنا من الخلايا لتحديد غير منحازة للجينوم الفيروسي البروتينات المرتبطة بالطيف الكتلي. إيبوند كان مفيداً لتحقيق ديناميات شوكة الخلوية النسخ المتماثل.

لتنقية الانتقائي للجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة، تكرار فدنا هو المسمى مع اثينيل تعديل نوكليوسدس، 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-اثينيل-2´-ديوكسيسيتيديني (EdC) (الشكل 1)، تليها التساهمية انقر اقتران لأزيد البيوتين عن طريق الكيمياء تيسيرا لتنقية خطوة واحدة من الجينوم الفيروسي والبروتينات المرتبطة بها على الخرز streptavidin المغلفة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تنفذ العدوى في الخلايا الثابتة، التي لم تشارك في تكرار الحمض النووي الخلوي لتمكين العلامات المحددة من فدنا. وعلاوة على ذلك، هامبورغ-1 العدوى يؤدي دورة الخلية اعتقال ويحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي^23،24. الفيروسات يمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسية الواردة (الشكل 1A) أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B) ²⁵-وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)²⁶. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساهمي مترافق تعديل اثينيل فدنا إلى فلوروفوري للتحقيق المكاني لديناميات البروتين (الشكل 2A و الشكل 3). تصوير يسمح للتصور مباشرة من فدنا وهو نهج مجانية للتحقق التفاعلات فدنا بالبروتين، ويمكن تكييفها لتعقب الجينوم الفيروسي في جميع أنحاء العدوى. ونحن نتوقع أن هذه النهج يمكن تعديله أيضا لدراسة أي جانب من الإصابة هيربيسفيرال، بما في ذلك الكمون وتنشيطها، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع أردين 5-اثينيل (الاتحاد الأوروبي) قد تسمح لتحليل الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي.

Protocol

1-خلية ثقافة والعدوى الفيروسية، ووسم الصادرات ( الشكل 1) البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى المؤسسة الخاصة بك ' s بروتوكولات السلامة البيولوجية فيما يتعلق بالمناولة الآمنة للفيروسات وغيرها من العناصر البيولوجية. هذا البروتوكول…

Representative Results

وأنجز استخدام الكيمياء انقر لتنقية الحمض النووي من الخلايا أولاً ب أسلوب إيبوند21. وغرض إيبوند لتنقية شوك الخلوية النسخ المتماثل للتعرف على البروتينات المرتبطة بها. أننا قد تكيفت هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين فدنا على وجه التحديد أثناء الإصابة. التلا?…

Discussion

ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البرو?…

Materials

MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer			prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2X Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C