Rensning af Viral DNA til identifikation af tilknyttede Viral og cellulær proteiner

Summary

Målet med denne protokol er specifikt tag og selektivt isolere viral DNA fra inficerede celler til karakterisering af virale genom forbundet proteiner.

Abstract

Målet med denne protokol er for at isolere herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA fra inficerede celler til identifikation af forbundet viral og cellulær proteiner af masse massespektrometri. Selv om proteiner, der interagerer med viral genomer spiller vigtige roller i afgøre udfaldet af infektion, var en omfattende analyse af virale genom forbundet proteiner ikke tidligere muligt. Her viser vi en metode, der muliggør direkte rensning af HSV-1 genomer fra inficerede celler. Replikerende viral DNA er selektivt mærket med modificerede nukleotider, der indeholder en alkyn funktionelle gruppe. Mærket DNA er så specifikt og uigenkaldeligt markeret via den kovalente fastgørelse af biotin indeholder via en kobber (I)-katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition eller klik reaktion. Biotin-mærkede DNA er renset på streptavidin-belagte perler og tilknyttede proteiner er elueret og identificeret ved massespektrometri. Denne metode gør det muligt for selektiv målretning og isolation af HSV-1 replikation gafler eller hele genomer fra komplekse biologiske miljøer. Derudover tilpasning af denne tilgang vil gøre det muligt for undersøgelse af forskellige aspekter af herpesviral infektion, samt undersøgelse af genomer af andre DNA virus.

Introduction

Virus har en begrænset kapacitet til at udføre væsentlige funktioner og derfor afhænge af host faktorer til at lette kritiske aspekter af infektioner herunder virale Gen-ekspression, replikering, reparation, rekombination og transport. Aktiviteterne i disse vært faktorer er ofte forstærket af viralt kodede proteiner. Derudover skal virus undgå afsløring og indblanding af cellulære svar til viral infektion. Derfor, virus værtssammenspil diktere resultatet af infektion. Altafgørende forståelse af hvordan virus ændrer den cellulære miljø for at tilpasse den cellulære maskiner for at lette viral processer. Af særlig interesse er at identificere hvilke faktorer og processer, handle på viral genomer i hele den smitsomme cyklus.

Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) er en dobbelt strandede DNA-virus, der inficerer en betydelig del af den menneskelige befolkning. Inden for den første time af infektion træder det virale genom atomkernen, hvor en bestilt kaskade af viral genekspression ensues i koordination med viral DNA (vDNA) replikering¹. I kernen, genomer er underlagt epigenetisk regulering, gennemgå reparation og rekombination, og er pakket ind i capsids, således at de første afkom virioner produceres i mindre end seks timer. Den omfattende evaluering af virale genom forbundet proteiner i løbet af infektion vil lægge fundamentet for at undersøge de molekylære detaljer af processer, der fungerer på viral genomer, og vil give indblik i hvilke viral og cellulær faktorer er involveret i forskellige stadier af infektion.

Tidligere metoder til undersøgelse af vært faktorer involveret i viral infektion omfatter affinitet rensning af virale proteiner til analyse af tilknyttede cellulære proteiner^{2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9}. disse assays har været medvirkende til identifikation af cellulære faktorer involveret i vært antiviral svar samt viral kromatin modifikation, genekspression, og DNA reparation. Det er imidlertid vanskeligt at fastslå, om interaktioner afhænger af foreningen med vDNA, og proteomics kun giver indsigt i samspil, der opstår som en funktion af en specifik viral faktor. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er blevet brugt til at identificere, hvor specifikke viral og cellulær proteiner binder til viral genomer^{10,11,12,13,14 , 15} og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) kombineret med immuncytokemi har aktiveret visualisering af cellulære faktorer, der colocalize med vDNA^{16,17,18, 19 , 20}. disse assays mulighed for rumlige og tidsmæssige analyse. Dog omfatter begrænsninger behovet for meget specifikke antistoffer, begrænset følsomhed og behovet for tidligere indsigt i virus værtssammenspil. Vi har derfor udviklet en metode baseret på iPOND (isolation af proteiner på spirende DNA)²¹ og aniPOND (accelereret indfødte iPOND)²² til selektivt etiket og rense vDNA fra inficerede celler til objektiv identifikation af virale genom tilknyttede proteiner af massespektrometri. iPOND har været medvirkende til undersøgelse af cellulære replikation gaffel dynamics.

Til selektiv rensning af viral genomer fra inficerede celler er replikere vDNA mærket med ethynyl modificeret Nukleosider, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), efterfulgt af kovalent konjugation at biotin indeholder via Klik på kemi til at lette trinvist rensning af viral genomer og tilknyttede proteiner på streptavidin-belagte perler (figur 2B). Vigtigere, er infektioner udført i stationære celler, som ikke er involveret i cellulære DNA-replikation at aktivere særlige mærkning af vDNA. Derudover HSV-1 infektion forårsager celle cyklus anholdelse og hæmmer cellulære DNA replikation^23,24. Virus kan prelabeled før infektionen til analyse af proteiner forbundet med indgående viral genomer (figur 1A) eller mærket under DNA replikation til analyse af proteiner forbundet med nyligt syntetiserede vDNA (figur 1B) ²⁵. Desuden puls chase analyse kan bruges til at undersøge karakteren af proteiner forbundet med viral replikation gafler (figur 1 c)²⁶. Derudover kan ethynyl-modificerede vDNA kovalent konjugeret med et fluorophore for fysisk undersøgelse af protein dynamics (figur 2A og figur 3). Imaging giver mulighed for direkte visualisering af vDNA og er en gratis tilgang til validering af vDNA-protein interaktioner, og kan tilpasses til at holde styr på viral genomer hele infektion. Vi forventer, at disse metoder kan ændres yderligere, at studere ethvert aspekt af herpesviral infektion, herunder ventetid og reaktivering, og til at studere andre DNA virus. Desuden kan mærkning med 5-ethynyl uridine (EU) tillade til analyse af RNA viral genomer.

Protocol

1. cellekultur, virusinfektion og EdC mærkning ( figur 1) følgende protokol omfatter arbejde med virus. Der henvises til din institution ' s bio-sikkerhed protokoller vedrørende sikker håndtering af vira og andre biologiske agenser. Denne protokol blev godkendt af det institutionelle Review Board af University of Pittsburgh. Trypsinize en sammenflydende 150 cm 2 vævskultur kolbe af MRC-5 celler og overføre cellerne til en 600 cm <s…

Representative Results

Brugen af klik kemi til oprensning af DNA fra celler blev først udført af den iPOND metode21. Formålet med iPOND er at rense cellulære replikation gafler til identifikation af tilknyttede proteiner. Vi har tilpasset denne teknik til at studere specifikt vDNA protein interaktioner under infektion. Manipulation af tilgang til label viral genomer med EdC (figur 1), kombineret med synkroniserede infektioner, har tilladt til selektiv is…

Discussion

Denne protokol omfatter flere trin, som, hvis ikke fulgt nøje, kan medføre betydeligt reduceret protein udbytte eller kontaminering med cellulære DNA. Det er afgørende at stationære celler anvendes til alle eksperimenter for at cellulære DNA ikke er mærket og renset. Dette kan bekræftes ved manglen på cellulære DNA polymeraser i eksemplet protein fordi HSV-1 ikke udnytte cellulære DNA polymerase for genom syntese. Under EdC mærkning og kerner høst trin, bør prøver fordeles til at sikre, at alle behandles l…

Materials

MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer			prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2X Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C