अतिव्यापी पेप्टाइड लाइब्रेरी एक प्रोटीन में क्यूए-1 Epitopes नक्शा करने के लिए
Summary
क्यूए-1 (मानव में एचएलए ई) गैर शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b अणुओं के एक समूह के अंतर्गत आता है । क्यूए-1-बाध्यकारी epitopes के साथ प्रतिरक्षण ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा विनियमन बढ़ाने और कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों उंनति करने के लिए दिखाया गया है । इस के साथ साथ हम एक प्रोटीन में गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes की पहचान के लिए एक अतिव्यापी पेप्टाइड पुस्तकालय रणनीति का वर्णन ।
Abstract
क्यूए-1 (मानव में एचएलए-ए) गैर-शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b (MHC-आईबी) अणुओं के एक समूह से संबंधित है । हाल के आंकड़ों का सुझाव है कि गुणवत्ता आश्वासन-1 अणु संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता के लिए कोशिकाओं के सर्वेक्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रतिरक्षा विनियमन उत्प्रेरण, और वायरल संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सीमित । इसके अतिरिक्त, गुणवत्ता आश्वासन के कार्यात्मक वृद्धि-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं epitope प्रतिरक्षण के माध्यम से कई स्व-प्रतिरक्षित रोग पशु मॉडल में उपचारात्मक प्रभाव दिखाया गया है, जैसे प्रयोगात्मक एलर्जी encephalomyelitis, कोलेजन प्रेरित गठिया, और गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह. इसलिए, वहां एक विधि है कि कुशलतापूर्वक और जल्दी से एक प्रोटीन में कार्यात्मक क्यूए-1 epitopes की पहचान कर सकते है के लिए एक तत्काल जरूरत है । यहाँ, हम एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes निर्धारित करने के लिए एक अतिव्यापी पेप्टाइड (OLP) पुस्तकालय के लिए विशेष गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ T सेल लाइनों का उपयोग करता है एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस OLP पुस्तकालय 15 मेर अतिव्यापी पेप्टाइड कि एक प्रोटीन की पूरी लंबाई को कवर किया है, और आसंन पेप्टाइड्स 11 अमीनो एसिड से ओवरलैप होते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने हाल ही में एक 9-मेर क्यूए-1 epitope myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) में पहचान की । इस नए मैप मोग क्यूए-1 epitope epitope-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं है कि बढ़ाया myelin-विशिष्ट प्रतिरक्षा विनियमन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था । इसलिए, इस प्रोटोकॉल उपंयास लक्ष्यों और गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं के कार्यों के भविष्य की जांच के लिए उपयोगी है ।
Introduction
क्यूए-1 चूहों में गैर-शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b (MHC-आईबी) अणुओं के एक समूह के अंतर्गत आता है । इसका मानव homolog एचएलए-ए है. पिछले सबूत दिखा दिया है कि क्यूए-1 अणुओं महत्वपूर्ण जैविक कार्य किया है । सबसे पहले, क्यूए-1 अणु संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता के लिए कोशिकाओं के सर्वेक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस संबंध में, क्यूए-1 अणुओं एक सेल के सामांय कार्य की निगरानी करने के लिए कई रणनीतियों विकसित किया है । एक ऐसी रणनीति क्यूए-1 अणु एक प्रसंस्कृत नेता पेप्टाइड (epitope), अर्थात् क्यूए-1 निर्धारक संशोधक (Qdm) है कि शास्त्रीय MHC-Ia अणुओं से संसाधित है endoplasmic जालिका1के साथ परिसरों के रूप में सक्षम बनाता है । ये क्यूए-1/Qdm परिसरों बाद में एक सेल की सतह पर प्रदर्शन और NK कोशिकाओं पर NKG2A रिसेप्टर्स निरोधात्मक करने के लिए बाँध NK हत्या गतिविधि को बाधित करने के लिए2. यदि MHC-Ia अणुओं की अभिव्यक्ति खो दिया है, एक सेल (उदाहरण के लिए एक घातक सेल) NK की हत्या के लिए संवेदनशील हो जाता है2। अंय रणनीति गुणवत्ता आश्वासन-1 अणुओं के लिए एक सेल की सतह पर नए क्यूए-1/epitope परिसरों के रूप में सक्षम बनाता है कि नल में कमी है (ट्रांसपोर्टर प्रतिजन प्रसंस्करण के साथ जुड़े)3 और/या ERAAP (endoplasmic जालिका aminopeptidase से जुड़े antigen प्रसंस्करण)4 (दोनों की कमी अक्सर घातक कोशिकाओं में होती है) । इन नए क्यूएस-1/epitope परिसरों को अभिव्यक्त करने वाले कक्ष को epitope-विशिष्ट क्यूएस-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं द्वारा पहचाना और समाप्त किया जा सकता है । दूसरे, क्यूए-1 अणु प्रतिरक्षा विनियमन5प्रेरित । इस संबंध में, क्यूए-1/epitope परिसरों में सीडी+ विनियामक टी (Treg) कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है जो स्व-ऊतकों की प्रतिरक्षा-मध्यस्थता क्षति की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण हैं6,7,8 ,9,10. तीसरे, क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ Treg कोशिकाओं वायरल संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए दिखाया गया है11.
इसलिए, epitope के विशिष्ट वृद्धि-विशिष्ट क्यूए-1-restrictred सीडी+ टी कोशिकाओं असामांय कोशिकाओं के उंमूलन के लिए एक संभावित आशाजनक रणनीति है, प्रतिरक्षा विनियमन की वृद्धि के लिए, और के परिमाण के नियंत्रण के लिए वायरस प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं । हालांकि यह निर्धारित नहीं किया गया है कि epitope की वृद्धि-विशिष्ट क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा निगरानी और सीमा वायरस प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने कर सकते हैं, हमारी प्रयोगशालाओं और दूसरों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया है कि गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes के साथ प्रतिरक्षण क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ Treg कोशिकाओं रोगजनक स्व-प्रतिरक्षित सीडी+ टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट, सीडी+ टी कोशिका के कुशल नियंत्रण के लिए अग्रणी के समारोह में वृद्धि कर सकते है एक में मध्यस्थता स्व-प्रतिरक्षित रोग ऐसे प्रयोगात्मक एलर्जी encephalomyelitis के रूप में पशु मॉडलों की विविधता (मानव एकाधिक स्केलेरोसिस के एक पशु मॉडल)6,10, कोलेजन प्रेरित गठिया (मानव रुमेटी गठिया के एक जानवर मॉडल)7, और गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मानव प्रकार के एक पशु मॉडल 1 मधुमेह)8. इसके अतिरिक्त, हम एक ऊतक के साथ प्रतिरक्षण की खोज की है-विशिष्ट क्यूए-1 epitope सीडी+ Treg कोशिकाओं12की वृद्धि के माध्यम से है कि ऊतक में प्रतिरक्षा मध्यस्थता सूजन के विशिष्ट नियंत्रण की ओर जाता है. पूर्व नैदानिक अध्ययन के ऊपर की सफलता गुणवत्ता आश्वासन-1 epitope प्रतिरक्षण के ऊतक के उपचार के लिए एक पूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता से संकेत मिलता है-विशिष्ट प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोगों और संभावित नल में कमियों के साथ जुड़े अन्य रोगों की चिकित्सा के लिए और ERAAP ।
तदनुसार, एक तकनीक है कि मज़बूती से और जल्दी से एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes का विश्लेषण कर सकते है के लिए एक मांग है । इस संबंध में, जैविक रूप से महत्वपूर्ण क्यूएस-1 epitopes की एक सीमित संख्या बताई गई है । इन क्यूए-1 epitopes के अधिकांश जीवाणुओं को सीडी+ टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के दौरान serendipitously की पहचान की गई13,3नल में कमी कोशिकाओं, ERAAP4में कमी कोशिकाओं, और कोशिकाओं है कि EAE6कारण, 9. इसलिए, एक उच्च प्रवाह तकनीक एक परिभाषित प्रोटीन में जैविक रूप से महत्वपूर्ण क्यूए-1 epitopes की पहचान के लिए वांछनीय है । निम्न में, हम एक प्रोटीन के OLP पूल (OLP_pool) के लिए विशेष गुणवत्ता आश्वासन-1-resrticted सीडी+ टी सेल लाइनों का उपयोग कर एक प्रोटीन में कार्यात्मक क्यूए-1 epitopes नक्शे एक अतिव्यापी पेप्टाइड (OLP) पुस्तकालय रणनीति का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । इस प्रोटोकॉल के संबंध में, कई अंय रणनीतियों पहले भी बताया गया था । सबसे पहले, allogeneic सीडी+ टी सेल लाइनों और क्लोन Qd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे तकनीकी सहायता और इस पांडुलिपि की तैयारी के लिए पेनेलोप गार्सिया धंयवाद । इस काम को लोमा लिंडा यूनिवर्सिटी (681205-2967) में मेडिसिन विभाग से एक रिसर्च इनोवेशन ग्रांट (रिग) द्वारा सपोर्ट किया गया और नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी (PP1685) से मिस्टर को एक पायलट अनुदान दिया गया ।
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
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