Summary
QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l'identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.
Abstract
QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib). Dati recenti suggeriscono che Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante in rilievo le cellule per l'integrità strutturale e funzionale, inducendo la regolazione immunitaria e limitando la risposta immunitaria alle infezioni virali. Inoltre, l'aumento funzionale della Qa-1-restricted CD8+ T cellule tramite epitopo immunizzazione ha mostrato effetti terapeutici in diversi modelli animali di malattia autoimmune, ad esempio l'encefalomielite allergica sperimentale, l'artrite indotta da collagene e diabete non obesi. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di un metodo che può efficacemente e rapidamente identificare gli epitopi in una proteina funzionali-Qa-1. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Qa-1-restricted CD8+ cellula T linee specifiche per una libreria peptidica (OLP) sovrapposti per determinare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. Questa libreria OLP contiene peptidi sovrapposti 15-mer che coprono tutta la lunghezza di una proteina, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi. Usando questo protocollo, abbiamo recentemente identificato un epitopo di Qa-1 9-mer alla della glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG). Questo appena mappata epitopo di MOG Qa-1 è stato indicato per indurre CD8 epitopo specifico, Qa-1-restricted+ T cellule che una maggiore regolazione immunitaria mielina specifici. Di conseguenza, questo protocollo è utile per la ricerca futura di nuovi bersagli e funzioni di Qa-1-restricted CD8+ T cellule.
Introduction
QA-1 appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib) in topi. Suo omologo umano è HLA-E. La prova precedente ha dimostrato che le molecole di Qa-1 hanno importanti funzioni biologiche. In primo luogo, Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante nel rilevamento topografico di cellule per integrità strutturale e funzionale. A questo proposito, Qa-1 molecole hanno evoluto strategie diverse per monitorare la funzione normale di una cella. Una tale strategia consente Qa-1 molecole per formare complessi con un peptide leader trasformati (epitopo), cioè il Qa-1 determinante modificatore (Qdm) che viene elaborato da molecole di MHC-Ia classiche nel reticolo endoplasmatico1. Questi complessi di Qa-1/Qdm successivamente visualizzano sulla superficie di una cellula e associare a recettori inibitori NKG2A sulle cellule NK per inibire NK uccidendo attività2. Se l'espressione di molecole MHC-Ia è perduto, una cella (ad es. una cellula maligna) diventa sensibile alla NK uccidendo2. L'altra strategia consente Qa-1 molecole per formare nuovi complessi di Qa-1/epitopo sulla superficie di una cellula che è carente in TAP (trasportatore associate all'elaborazione dell'antigene)3 e/o ERAAP (reticolo endoplasmico aminopeptidasi associati elaborazione dell'antigene)4 (entrambe le carenze si verificano spesso in cellule maligne). La cellula che esprime questi nuovi complessi di Qa-1/epitopo può quindi essere riconosciuta ed eliminata dall'epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule. In secondo luogo, Qa-1 molecole inducono regolazione immunitaria5. A questo proposito, Qa-1/epitopo complessi sono stati indicati per stimolare CD8+ cellule regolarici di T (Treg) che sono importanti per la prevenzione del danno immune-mediato di auto-tessuti6,7,8 ,9,10. In terzo luogo, Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule sono state indicate per limitare le risposte immunitarie contro l'infezione virale11.
Pertanto, l'incremento specifico di epitopo specifico Qa-1-restrictred CD8+ T cellule è una strategia potenzialmente promettente per l'eliminazione delle cellule anormali, per il miglioramento della regolazione immune e per il controllo dell'entità del risposte immunitarie indotta da virus. Mentre esso non è stato determinato se l'incremento di epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule possono aumentare la sorveglianza immune e limitare le risposte immunitarie indotta da virus, i nostri laboratori e altri hanno dimostrato chiaramente che immunizzazione con gli epitopi Qa-1 può aumentare la funzione di Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule specifiche per patogeni autoimmuni CD4+ T cellule, con conseguente controllo efficiente di CD4+ malattie autoimmuni T cellulo-mediata in un modelli di varietà di animali come encefalomielite allergica sperimentale (un modello animale della sclerosi multipla umana)6,10, artrite indotta da collagene (un modello animale dell'artrite reumatoide umana)7, e diabete non obesi (un modello animale del diabete di tipo 1 umano)8. Inoltre, abbiamo scoperto che l'immunizzazione con un epitopo di Qa-1 tessuto-specifici conduce al controllo specifico di infiammazione immune-mediata in quel tessuto attraverso l'aumento di CD8+ Treg cells12. I successi precedenti studi preclinici indicano la necessità di una valutazione completa di immunizzazione di epitopo Qa-1 per il trattamento di malattie immuno-mediate di tessuto-specifici e, potenzialmente, per la terapia di altre malattie connesse con le mancanze nel rubinetto e ERAAP.
Di conseguenza, esiste una domanda per una tecnologia che può attendibilmente e rapidamente analizzare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. A questo proposito, è stato descritto un numero limitato di epitopi Qa-1 biologicamente importanti. La maggior parte di questi epitopi di Qa-1 sono stata identificata serendipitously durante lo studio di CD8+ T cell responses to batteri13, le cellule carenti di rubinetto3, le cellule carenti di ERAAP4e le cellule che causano EAE6, 9. Pertanto, una tecnica di elevato throughput è auspicabile per l'identificazione di epitopi di Qa-1 biologicamente importanti in una proteina definita. Di seguito descriviamo una strategia di libreria del peptide (OLP) sovrapposti che esegue il mapping funzionali epitopi di Qa-1 in una proteina usando CD8 Qa-1-resrticted+ cellula T linee specifiche per il pool di OLP (OLP_pool) di una proteina.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con un protocollo di utilizzo approvato dal comitato di impiego presso l'Università del Texas a El Paso e Loma Linda University e cura degli animali e istituzionali Animal Care.
1. generazione di una libreria OLP che coprono l'intera lunghezza di una proteina
- Progettare una libreria OLP in cui tutti i peptidi sono 15-mer in lunghezza, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi.
Nota: Nello studio MOG OLP, sequenza del precursore MOG [Mus musculus] è stato estratto dal database della proteina di NCBI seguendo questo link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Il precursore MOG (247 aminoacidi), che conteneva sia segnale che peptidi maturi, è stato utilizzato perché la maggior parte degli epitopi di Qa-1 (HLA-E) segnalati sono stata situata in peptidi di segnale (ad esempio Qdm1). All'inizio della sua estremità N-terminale, le sequenze di 15-mer peptidi sono state identificate tale che due peptidi adiacente sovrappongono da 11 aminoacidi (Figura 1). Quindi, esattamente 59 OLPs sono stati identificati nel precursore dell'aminoacido 247 MOG. Tuttavia, l'OLP scorso può variare da 12 a 15-mer a seconda della lunghezza della proteina. Inoltre, abbiamo scelto 15-mer biblioteca perché noi ed altri abbiamo dimostrato che 15-mer peptidi, quando aggiunto in cellule dendritiche (DCs) o macrofagi, possono essere efficientemente trasformati in epitopi per riconoscimento di CD8+ T cellule14,15 . - Acquistare ogni singolo peptide commercialmente. 5 mg al peptide dovrebbe essere sufficiente per lo screening. OLPs e peptidi troncati (passo 6.1) possono essere dissalate peptidi (purezza è circa 50-70%). La purezza del peptide ottima (punto 6.2) che verrà utilizzato per la generazione del tetramero e per future analisi biologiche deve essere > 90%. Ricostituire i peptidi in condizioni sterili.
- Fanno scorte di peptide individuale di 50 mg/mL in 100% DMSO. Per 5 mg di ciascun peptide, aggiungere 100 μL di DMSO in ogni provetta, mescolare e conservare i peptidi a-20 ° C. Questi stock verranno utilizzati per fare un magazzino di OLP_pool per la generazione di CD8+ T cell lines reattiva per il OLP_pool. Inoltre, questi stock servirà anche a fare 10 mg/mL scorte di peptide individuali per determinare la capacità di ciascun peptide individuali per stimolare una risposta di Qa-1-limitati in un OLP_pool-reattiva CD8+ linea a cellula T.
- Marca OLP_pool stock aggiungendo un volume uguale di ciascun peptide in una nuova provetta. Questo stock OLP_pool contiene 100% DMSO. Nello studio MOG OLP, c'erano 59 OLPs12. Quindi, la concentrazione di ciascun peptide nella OLP_pool era 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
- Fanno 10 mg/mL del peptide individuali scorte di diluzione (5x) lo stock di 50 mg/mL in sterile di H2O in un piatto fondo V 96 pozzetti (questo stock contiene 20% DMSO). Fanno queste scorte in una piastra a 96 pozzetti, poiché la determinazione della risposta Qa-1-limitati di ciascun peptide individuali non verrà eseguita in una piastra a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale a 8 o 12 canali.
Nota: Tutti i peptidi, tra cui OLPs e peptidi troncati, devono essere diluiti in entrambi un piatto fondo V 96 pozzetti o un rack 96 pozzetti campione riempito con 1 mL provette poiché lo screening di libreria del peptide viene eseguito in piastre da 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Se è difficile diluire un peptide, aggiungere 1 goccia di NaOH N saggio per aiutare a sciogliere il peptide.
2. innesco di Kb-/- Db-/- CD8+ le cellule di T con la K OLP_pool-pulsatab-/- Db-/- cellule dendritiche (DCs).
Nota: Ci sono due principali Qa-1 alleli: uno è Qa-1una, e l'altro è Qa-1b. Poiché gli animali comunemente usati per la ricerca accademica, per esempio C57BL/6 e topi Balb/c, trasportare Qa-1b, questo protocollo descrive la procedura per la mappatura di Qa-1b epitopi in una proteina. CD8+ T cellule utilizzate in questo protocollo sono purificate da Kb-/-Db-/- topi (sfondo C57BL/6) in quale CD8+ T cellule sono limitate principalmente da molecole di MHC-Ib non classici tra cui Qa-1.
- Prodotti derivanti dal midollo osseo DCs come precedentemente descritto12.
- Brevemente, cultura sospensioni di singole cellule del midollo osseo (1 x 106 cellule/mL) nel medium RPMI-10 (RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale, 5.5 x 10-5 M. 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 0,1 mM aminoacido non essenziale) contenente 10 U/mL IL-4 e 100 U/mL GM-CSF in una piastra a 6 pozzetti (4 mL/pozzetto) a 37 ° C, 5% CO2.
- Due giorni dopo, rimuovere cellule non aderenti con cura e aggiungere citochine e media fresco.
- Dopo la coltura le cellule per altri due giorni, trasferimento di cellule non aderenti contenente media fresco e citochine in una nuova piastra 6 pozzetti.
- Le cellule della coltura per altri due giorni e rifornito con media fresco e citochine contenente LPS (0,1 µ g/mL) per attivare i controller di dominio.
- 24 ore più tardi, raccogliere i controller di dominio per gli esperimenti.
- Irradiare il DCs con 3000 rad.
- In alternativa, trattare il DCs (5 x 107 cellule/mL) con mitomicina C (50 μg/mL) in PBS a 37 ° C per 20 min. aggiungere RPMI-0 (RPMI 1640 senza siero) per riempire il tubo (~ 12 mL) e far girare le cellule per 10 min in una centrifuga di tavolo a 300 x surnatanti di g. scartare e ripet t la procedura di lavaggio due volte. Questi tre lavaggi sono critici perché qualsiasi quantità in tracce di mitomicina C può inibire la risposta di CD8+ T cellule durante la co-coltura di cellule DC-T.
- Regolare la concentrazione di DC a 5 x 106 cellule/mL in un medium privo di siero (AIM-V senza siero supplementato con 5.5 x 10-5 M. 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 0,1 mM aminoacido non essenziale).
- Aggiungere la soluzione madre di OLP_pool, che contiene 100% DMSO, ai controller di dominio, tale che la concentrazione di DMSO finale sarà 0,5% (200 x). Nello studio MOG OLP, la concentrazione di ciascun OLP nella OLP_pool era 847.46 μg/mL; da qui la concentrazione finale di ogni OLP nella cultura DC era 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Nota: CD8+ T cellule da mouse milza e linfonodi possono essere purificate utilizzando Kit di isolamento positivo CD8 seguendo le istruzioni fornite dal produttore. CD8+ T cellule ottenute sono liberi di perline.
3. restimolazione del CD8 innescato+ T cellule con macrofagi ha pulsato con l'OLP_pool
- Quattro giorni prima di re-stimolo del CD8 innescato OLP_pool+ T cellule, preparare soluzione al 2% (v/v) poliacrilammide perlina: lavare 2 g di perle di poliacrilammide due volte in 20 mL privo di endotossina H2O o PBS. A pellet le perline di poliacrilammide mediante centrifugazione (400 x g) per 5 min e risospendere in 100 mL di PBS. Sterilizzare in autoclave a 15 lb/m per 20 min. Store a temperatura ambiente.
- Iniettare topi intraperitonealmente con 1 mL/mouse della sterile soluzione 2% poliacrilammide perlina per attirare la migrazione dei monociti/macrofagi nella cavità peritoneale16.
- Quattro giorni più tardi, sacrificare gli animali dalla dose eccessiva di CO2 .
- In condizioni di sterilità, tagliare una piccola apertura al centro dell'addome in modo che l'apertura è appena sufficiente per il passaggio di una pipetta di trasferimento di 5 mL. Riempire la pipetta con RPMI-0 e inserire la pipetta nella cavità addominale attraverso l'apertura.
- Sciacquare la cavità addominale di pipettaggio. Pipettare fuori quanto più liquido possibile dalla cavità addominale in una provetta sterile (questi sono i macrofagi peritoneali). Ripetere il passaggio di risciacquo 4 - 5 volte.
- Irradiare i macrofagi peritoneali con 3000 rad.
- In alternativa, trattare i macrofagi peritoneali con mitomicina C (seguire la procedura descritta al punto 2.2).
- Regolare la concentrazione dei macrofagi peritoneali a 5 x 106 cellule/mL nel medium privo di siero. Aggiungere il brodo di OLP_pool (la concentrazione di DMSO finale è meno dell'1%) e M-CSF (concentrazione finale = 100 U/mL).
Nota: In questo studio di MOG OLP, abbiamo usato 0,5% DMSO. Così, MOG OLP_pool stock era diluito 200 x (es. 1 μL di MOG OLP_Pool magazzino è stato aggiunto in 199 μL dei macrofagi peritoneali). Quindi, la concentrazione finale di ogni OLP era 4,2 μg/mL). - Aggiungere 200 μL/pozzetto (1 x 106 cellule/pozzetto) in una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti e incubare la piastra a 37 ° C per 4 h.
- Rimuovere le cellule non-aderenti e le perle di poliacrilammide lavaggio delicato con 200 μL/pozzetto del pre-riscaldato RPMI-0.
- Raccogliere e piscina il OLP_pool innescato CD8+ T cellule da passo 2.10. Regolare la OLP_pool innescato CD8+ concentrazione di cellule T a 1 x 106 cellule/mL nel medium privo di siero contenente 25 U/mL IL-2 e 50 U/mL di IL-7. Aggiungere 1 mL/pozzetto il 48-piastra che contiene i macrofagi peritoneali OLP_pool-pulsato.
- Quattro giorni più tardi, ricostituire il mezzo nella piastra 48 pozzetti. Rimuovere e scartare circa 400 μL di coltura nelle piastre di coltura 48 pozzetti. Aggiungere 500 μL di fresco medium privo di siero contenente 100 U/mL IL-2 e 100 U/mL di IL-7 in ogni pozzetto. Coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO2.
- Tre o quattro giorni dopo, esaminare il CD8 restimolate OLP_pool+ T cellule di risposta specifiche OLP_pool, Qa-1-limitati dall'analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT). Dopo questo punto, ri-stimolare il CD8+ T cellule ogni 7-10 giorni.
Nota: I macrofagi sono comodo per ri-stimolare il CD8 OLP_pool-innescato+ T cellule. Abbiamo notato che CD8+ T cellule ri-stimolate dal macrofago è cresciuto meglio di DCs in vitro.
4. la determinazione di specifiche OLP_pool, Qa-1-limitata risposta in un CD8 restimolate OLP_pool+ cellula T linea
Nota: OLP_pool-specific, Qa-1-limitata risposta in un CD8 restimolate OLP_pool+ linea a cellula T è determinato dalla secrezione di IFNγ dopo stimolazione da OLP_pool in presenza di C1R o C1R. QA-1b cellule usando un'analisi di IFNγ ELISPOT. C1r cellule possono essere ottenute commercialmente. C1R. QA-1b cellule possono essere generate da transducing C1R cellule con il vettore lentivirale Qa-1.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di un anticorpo anti-IFN-γ cattura diluito in tampone di rivestimento (PBS) nei pozzetti di una piastra ELISPOT.
- In alternativa, trattare il C1R e C1R. QA-1b cellule con mitomicina C come descritto in Step 2.2 salvo che la durata del trattamento sarà 30 min.
5. determinazione dei singoli peptidi nella OLP_pool che stimolano la secrezione di IFN-γ Qa-1 limitato in un CD8 specifici OLP_pool+ linea a cellula T
- Determinare i singoli peptidi che stimolano la OLP_pool-specifici, secrezione di IFN-γ Qa-1-restrictred in un OLP_pool specifico CD8+ linea a cellula T utilizzando il sopra descritto dosaggio di IFN-γ ELISPOT (concentrazione finale di ciascun peptide individuale utilizzato per la ELISOPT assay è 10 μg/mL). Vedere risultati rappresentativi nella Figura 3.
Nota: Un OLP-specifico, Qa-1-restircted risposta è definito come una risposta che è almeno tre volte della risposta in presenza di C1R. QA-1b cellule ma senza l'OLP. Nello studio di MOG OLP, OLP68, OLP96 e OLP105 tutti soddisfatti di questo criterio. Di conseguenza, tutti i tre OLPs contengono potenzialmente Qa-1 epitopi12 (Figura 3). Tuttavia, la OLP105 costantemente ha dato la risposta più forte; Abbiamo quindi effettuato una dettagliata analisi della OLP105 (Figura 4 e Figura 5)12.
6. identificazione dell'epitopo Qa-1 ottimale in un 15-mer OLP che stimola la risposta epitopo specifico, Qa-1-limitati in un CD8 specifici OLP_pool+ linea a cellula T
- Sintetizzare peptidi C - e N-terminalmente troncato di un 15-mer OLP come mostrato nella Figura 4.
- Esaminare la secrezione di IFN-γ in un CD8 specifici OLP+ linea a cellula T stimolando il CD8+ T cellule con ciascuno dei peptidi troncati, come pure l'OLP parentale 15-mer in presenza di C1R o C1R. QA-1b celle utilizzando il sopra descritto dosaggio di IFN-γ ELISPOT. La concentrazione finale di ciascun peptide specifico utilizzato per il test ELISPOT è 10 μg/mL. Un peptide è definito come l'epitopo di Qa-1 ottima se il peptide: 1) costantemente dà risposta di IFN-γ simile o più forte, rispetto al peptide originale 15-mer, in presenza di C1R. QA-1b cellule; 2) è compreso tra 8 - 10-mer (peptide di 9-mer preferito) che sono le lunghezze di peptide associate a MHC-sono molecole15,17. Vedere Risultati rappresentante nella Figura 5.
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Representative Results
Progettazione di una libreria OLP che coprono l'intera lunghezza di una proteina
All'inizio del N-terminale di una proteina, ogni peptide è 15 aminoacidi (15-mer). Quindi, il primo peptide si estende su posizione 1 alla posizione 15. N-terminale del peptide secondo si sovrappone con il C-terminale del peptide primo da 11 aminoacidi. Quindi, il secondo peptide si estende dalla posizione 5 alla posizione 19. Progettare il resto dei peptidi all'estremità del C-terminale della proteina (Figura 1). Abbiamo scelto la libreria 15-mer perché noi ed altri abbiamo dimostrato che 15-mer peptidi, quando aggiunto in cellule dendritiche (DCs) o macrofagi, possono essere efficientemente trasformati in epitopi per riconoscimento di CD8+ T cellule14,15. Il numero di OLPs in una raccolta dipende dalla lunghezza di una proteina. Inoltre, l'OLP scorso può variare da 12 a 15-mer a seconda della lunghezza della proteina. Ad esempio, della glicoproteina del oligodendrocyte di myelin (MOG) ha una lunghezza di 247 aminoacidi. La biblioteca di MOG OLP contiene 59 OLPs12. Risultati rappresentativi presentati in questo manoscritto sono dall'analisi della libreria MOG OLP.
Determinazione della risposta OLP_pool-specific, Qa-1-limitati in un OLP_pool-stimolata CD8+ linea a cellula T
Abbiamo generato un CD8+ linea a cellula T che è stato innescato da Kb-/-Db-/- DCs ha pulsato con MOG OLP_pool (MOG_pool) e restimolate di K MOG_pool-pulsatab-/-Db-/- macrofagi peritoneali come descritto nella detto protocollo (protocollo 1, 2 e 3). Per determinare la potenziale risposta MOG_pool-specific, Qa-1-limitati in questo CD8+ linea a cellula T, abbiamo esaminato la risposta di questo CD8+ linea a cellula T di MOG_pool in presenza di C1R o C1R. QA-1b cellule usando il dosaggio di IFN-γ ELISPOT (Figura 2) (punto 4 del protocollo). I nostri dati hanno dimostrato che il CD8 MOG_pool-stimolata+ linea a cellula T secernuto un basso livello di IFN-γ in presenza di C1R. QA-1b cellule (32 Spot formando cellule o Sfc) ma non cellule di C1R (2 Sfc), suggerendo la presenza di CD8+ T cellule che ha risposto agli epitopi di Qa-1-associazione derivati dalle cellule di C1R (C1R cellule sono cellule linfoblastoidi B). SFC sono stati aumentati quando il MOG_pool è stato aggiunto nel pozzo che conteneva cellule C1R (78 Sfc), suggerendo la presenza di CD8+ T cellule che ha risposto agli epitopi non Qa-1. SFC sono stati aumentati drammaticamente quando il MOG_pool è stato aggiunto nel pozzo che contenuti C1R. QA-1b cellule (320 Sfc), suggerendo la presenza di CD8+ T cellule che ha risposto ai peptidi Qa-1-associazione. I dati dimostrano anche che il MOG_pool contiene Qa-1-associazione PDGFR.
Determinazione dei singoli peptidi nella OLP_pool che contribuiscono alla secrezione di IFN-γ Qa-1-limitati in un OLP_pool-reattiva CD8+ linea a cellula T
Per determinare i peptidi in OLP_pool che ha stimolato la secrezione di IFN-γ Qa-1-limitati in un MOG_pool-reattiva CD8+ linea a cellula T, abbiamo stimolato il CD8 MOG_pool-reattiva+ T cellule con 59 OLPs individuale in presenza di entrambi C1R o C1R. QA-1b cellule (Figura 3) (protocollo passo 5). I nostri dati hanno mostrato che alcuni SFC sono stati osservati nei pozzetti che conteneva cellule C1R e il OLPs. Al contrario, SFC aumentato in tutti i pozzetti che contenuti C1R. QA-1b cellule e il OLPs. Dalla Figura 2, abbiamo imparato che CD8+ T cellule in presenza di C1R. QA-1b da solo anche formato Sfc. Pertanto, la SFC aumentato nella maggior parte dei pozzi potrebbe essere dovuto stimolazione aspecifica a seguito della presentazione di epitopi di Qa-1 derivate dalle proteine intracellulari nelle cellule C1R dalle molecole Qa-1. Tuttavia, OLPs 3 pozzetti con cornice in Figura 3 (B8, D12 ed E9), che ha trovato il 3 evidenziato OLPs in Figura 3A (OLP68, OLP96 e OLP105), ha incontrato il criterio per la definizione di una risposta di IFN-γ OLP specifici, Qa-1-limitati come descritto nel protocollo passaggio 5.112. I dati suggeriscono che il 3 OLPs contengono PDGFR Qa-1. Poiché il OLP105 prodotto costantemente la massima risposta, abbiamo effettuato una analisi dettagliata del OLP10512.
Progettazione di una libreria di peptide troncato per un 15-mer OLP
Un OLP 15-mer, che è stato determinato per stimolare la secrezione di IFN-γ Qa-1-limitati nel CD8 OLP_pool-reattiva+ linea a cellula T, devono essere analizzati per l'epitopo ottima utilizzando una libreria di peptide troncato. Tale libreria del peptide troncato è progettata troncando progressivamente l'OLP 15-mer da 1 dell'amminoacido al suo N - e C-termini (Figura 4). Simile ad altri MHC classe I molecole, Qa-1 molecole si legano principalmente a 8 - 10-mer peptidi. Si consiglia, pertanto, che il più corto peptide troncato è 6-mer in lunghezza.
Identificazione dell'epitopo Qa-1 ottima in un 15-mer OLP che stimola la secrezione di IFN-γ Qa-1-limitati in un OLP_pool-reattiva CD8+ linea a cellula T
I peptidi N - e C-terminale troncato sopra sono testati per la resistenza nella stimolante secrezione di IFN-γ in un CD8+ linea a cellula T specifico per l'OLP_pool o l'OLP 15-mer utilizzando l'IFN-γ ELISPOT descritto sopra. Nello studio degli epitopi di Qa-1 in MOG12, abbiamo generato un CD8+ linea a cellula T che era specifico per il OLP105 di MOG (Figura 5A). Ulteriore analisi ha dimostrato che la N-terminalmente peptide troncato 9-mer soddisfatta i due criteri per un epitopo ottimo come descritto nel protocollo passaggio 6.2 (figura 5B). Di conseguenza, abbiamo concluso che la N-terminalmente troncato 9-mer peptide era l'epitopo di Qa-1 ottima.
Figura 1: progettazione di una libreria OLP che coprono l'intera lunghezza di una proteina. All'inizio della N-terminale, peptidi di 15 lunghezza dell'amminoacido (15-mer) sono stati identificati.N-terminale di ciascun peptide, fatta eccezione per il primo peptide, sovrapposto con il C-terminale del peptide precedente da 11 aminoacidi.
Figura 2: MOG_pool-stimolata CD8+ T cellule erano parzialmente MOG_pool Qa-1-limitati e specifici12. In vitro CD8+ T cellule stimolate dal MOG OLP_pool (MOG_pool) sono state esaminate per la risposta alla MOG_pool in presenza di C1R o C1R. QA-1b cellule come cellule usando un'analisi di IFN-γ ELISPOT presentanti l'antigene. Rappresentante ELISPOT immagini vengono visualizzate. Numeri di posto-formare le cellule (Sfc) sono indicate negli angoli superiore sinistro di ciascun pozzetto. CD8+ T cellule: 50.000 cellule/pozzetto. C1r o C1R. QA-1b cellule: 200.000 cellule/pozzetto.
Figura 3: analisi di OLPs nella MOG_pool che erano responsabili per il Qa-1 limitata risposta. (A) Layout della piastra fondo V 96 pozzetti contenenti 10 mg/mL di singoli MOG OLPs. I numeri nei pozzetti rappresentati OLP IDs. Gli evidenziato 3 pozzi contenevano OLPs che ha soddisfatto il criterio per una risposta di IFN-γ OLP specifici, Qa-1-limitati come descritto nel protocollo passaggio 5.112. (B) rappresentante SFC in ciascun pozzetto contenente un OLP (concentrazione finale = 4,2 μg/mL, OLP ID che corrisponde a "A"), il MOG_pool-reattiva CD8+ T (50.000 cellule/pozzetto) e cellule C1R (200.000 cellule/pozzetto). (C) rappresentante SFC in ciascun pozzetto contenente un OLP (concentrazione finale = 4,2 μg/mL, OLP ID che corrisponde a "A"), il MOG_pool-reattiva CD8+ T cellule (50.000 cellule/pozzetto) e C1R. QA-1b cellule (200.000 cellule/pozzetto). I 3 pozzetti con cornice contenevano OLPs che ha soddisfatto il criterio per un specifico OLP, Qa-1-restricted IFN-γ risposta12. La figura è stata adattata da riferimento12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: progettazione di peptidi troncati di un peptide 15-mer. Un peptide 15-mer è stato progressivamente troncato al suo N - e C-termini di 1 amminoacido a 6-mer. 15-mer e suoi peptidi troncati allora sono stati sintetizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: analisi dell'epitopo Qa-1 ottima nella OLP105. (A) un OLP105-stimolata CD8+ linea a cellula T è stata esaminata per risposta al OLP68, OLP96 e OLP105 in presenza di C1R o C1R. QA-1b cellule usando un'analisi di IFN-γ ELISPOT. Sono mostrati rappresentante IFN-γ SFC (numeri negli angoli superiore sinistro). (B) il CD8 specifici OLP105+ linea a cellula T, come mostrato in (A), è stato esaminato per la risposta ai peptidi singoli N - e C-terminale troncato, come mostrato in Figura 4, in presenza di C1R. QA-1b cellule usando il dosaggio di IFN-γ ELISPOT. OLP105: un OLP 15-mer. N6-14: OLP105 peptidi N-terminalmente troncati. C6-14: OLP105 peptidi troncati in C-terminale. CD8+ T cellule: 50.000 cellule/pozzetto. C1R. QA-1b cellule: 200.000 cellule/pozzetto. I numeri in alto a sinistra angoli erano SFC per 50.000 CD8+ cellule T. Rettangolo rosso contrassegnato il pozzo che soddisfano i criteri per la definizione ottima epitopo Qa-1 in un OLP come descritto nel protocollo punto 6.2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'analisi di epitopi di Qa-1 in una proteina. In relazione al presente protocollo, parecchie altre strategie inoltre sono state segnalate precedentemente. In primo luogo, trapianto allogeneic CD8+ linee a cellula T e i cloni sono stati usati per l'identificazione del Qdm1. In secondo luogo, un motivo di Qa-1-legante presunto dall'analisi di Qdm è stato utilizzato per l'identificazione di HSP60p216-224 e un epitopo TCRBV8.19,18. In terzo luogo, singoli peptidi sovrapposti da una proteina sono stati usati per immunizzare gli animali. Successivamente, CD8+ T cellule isolate da animali immunizzati sono state usate per identificare il TCRBV8.2 peptide p42-50, che successivamente è stata confermata per l'associazione a Qa-16,10,19. In quarto luogo, funzionale CD8+ T cell lines in combinazione con libreria di cDNA display sono stati utilizzati per l'identificazione dell' epitopo FL9 Qa-14.
In riferimento alle tecniche precedenti, l'uso di trapianto allogeneic CD8+ T cell lines e cloni maggio non essere adatto per l'analisi di epitopi di Qa-1 che si sono presentati durante le risposte immunitarie fisiologiche. Inoltre, accumulando i dati suggerisca che il motivo di associazione descritti in precedenza solo parzialmente può rappresentare la capacità di legare il peptide di molecole di Qa-1. Pertanto, il motivo di Qa-1-associazione esatto non è ancora noto4. Inoltre, l'immunizzazione con il peptide individuo per l'identificazione di epitopi Qa-1 è laborioso. Infine, cDNA visualizzazione libreria strategia implica la costruzione di molti vettori che trasportano le lunghezze differenti del peptide per la transfezione delle cellule. Al contrario, la strategia di libreria OLP descritta qui è semplice, e i peptidi mappati sono noti per stimolare Qa-1-restricted CD8+ T cellule. Di conseguenza, la nostra strategia ha un vantaggio unico.
La strategia descritta qui usa CD8 specifici OLP_pool+ T cellule che vengono generati in vitro adescamento e restimolazione. Una fonte alternativa del CD8+ T le cellule possono essere da scarico dei linfonodi di un kb-/-Db-/- mouse che è immunizzato con la fonte della proteina20. Tale sistema immunitario CD8+ T cellule possono quindi essere esaminate per risposte IFN-γ OLPs e peptidi troncati per l'identificazione di epitopi Qa-1. Teoricamente, l' in vivo immuni CD8+ T cellule sono più vicini alla condizione fisiologica che lo in vitro generato CD8+ T cellule. Tuttavia, abbiamo trovato che la risposta del sistema immunitario CD8+ T cellule direttamente purificate da topi immunizzati era debole e spesso richiesto in vitro restimulations per un peptide soddisfacente risultato di selezione. Inoltre, questo protocollo è progettato per futuri traduzione allo studio nell'uomo di epitopi di HLA-E in cui in vivo immunizzazione non è pratico.
Tecnicamente, la parte critica del presente protocollo è la generazione di CD8+ T cell lines che sono specifici per il OLP_pool o un OLP individuali. Poiché complessi peptide-1/Qa sono instabili rispetto alla classica MHC-I/peptide complessi21, dopo cellule presentanti l'antigene sono pulsate con il OLPs o un peptide, le cellule pulsate non dovrebbero essere lavate estensivamente. Abbiamo trovato che cellule del peptide-pulsato, se lavati estensivamente, perdono o riducono in modo significativo la capacità di stimolare CD8+ T cellule. Pertanto, si consiglia di lavare il peptide-pulsato dell'antigene che presenta le cellule una volta immediatamente prima sono co-coltivate con CD8+ T cellule.
Inoltre, a causa dell'instabilità dei complessi peptide-1/Qa, si consiglia l'uso di un mezzo privo di siero per il pulsare del peptide e la stimolazione di CD8+ T cellule. Inoltre, aggiungiamo regolarmente 50 U/mL di IL-7 durante CD8+ T colture cellulari come pure durante l'IFN-γ ELISPOT analisi. Lo scopo di IL-7 è di mantenere la vitalità e la funzione di CD8+ T cellule. IL-7 da sè non stimola CD8+ T le cellule a produrre IFN-γ.
Simile a tutte le strategie, gli epitopi di Qa-1 mappati da questa strategia anche richiedono ulteriori indagini per significato biologico. Ad esempio, una domanda importante è se l'epitopo mappata possa essere fisiologicamente presentato. Per affrontare questa questione, DCs può essere trasdotte con un vettore lentivirale che esprime la proteina di origine epitopo (ad es. studio di MOG In the MOG OLP). Successivamente, la risposta di CD8 l'epitopo specifico+ T cellule trasdotte DCs è esaminato. Una risposta positiva suggerisce che l'epitopo può essere fisiologicamente elaborato e presentato da DCs. In aggiunta, le conseguenze funzionali a seguito del riconoscimento di epitopo di CD8+ T cellule devono essere ulteriormente approfondite. A questo proposito, le analisi degli epitopi Qdm e FL9 Qa-1 hanno portato alla conclusione che Qa-1 molecole sono importanti per sorveglianza immune1,4. Inoltre, gli studi di HSP60p216, TCRBV8.1 del peptide, e p42-50 hanno portato alla conclusione che CD8 Qa-1-restricted+ T cellule regolano le risposte immunitarie attraverso il targeting patogeni CD4 cellule+ T 6,7 ,9,19. Inoltre, lo studio del MOG196 ha per la prima volta ha rivelato che Qa-1-restricted CD8+ T cellule potrebbero regolare le risposte immunitarie mirando direttamente un tessuto per impedire danni da cellule autoimmuni potenzialmente patogeni12 . Infine, l'analisi funzionale di un epitopo specifico, Qa-1-restricted CD8+ delle cellule T possono essere assistiti da tetramero. Tali tetramero può essere prodotto in funzione di memoria di tetramero NIH (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) o una società. Per richiedere la generazione di un tetramero, uno può inviare i dati funzionali che supportano l'associazione dell'epitopo Qa-1 ottima appena mappata alla proteina di Qa-1 per la loro approvazione per la generazione di un tetramero di Qa-1.
In conclusione, gli studi precedenti hanno dimostrato che CD8 Qa-1-restricted+ T cellule svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta immunitaria locale12. A questo proposito, danni del tessuto possono essere causati da una risposta immunitaria che si rivolge direttamente il tessuto. Inoltre, i danni collaterali possono essere causati da una risposta immunitaria che gli obiettivi di un agente patogeno invasore. Quindi, comprendere il ruolo di Qa-1-restricted CD8+ T cellule in questi due tessuti diversi danni è importante per le loro applicazioni cliniche.Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria un'analisi approfondita degli epitopi di Qa-1 in un auto-tessuto o un agente patogeno invasore. Questo protocollo sarà adatto per queste analisi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Penelope Garcia per la sua assistenza tecnica e la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca innovazione (RIG) dal dipartimento di medicina all'Università di Loma Linda (681205-2967) e un pilota grant dal National Multiple Sclerosis Society (PP1685) a XT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
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