Summary
Detta protokoll studier chemokine (C-C motiv) ligand 5 (CCL5) i hypotalamus roll genom att leverera en antagonist, MetCCL5, in i musen hjärnan använder ett mikro-osmotic pumpsystem hjärnan infusion. Detta övergående hämning av CCL5 verksamhet avbryts hypotalamus insulin signalering, vilket leder till glukosintolerans och perifera systemiska insulinkänslighet.
Abstract
Insulin reglerar systematisk ämnesomsättning i hypotalamus och perifer insulinresistens svar. En inflammatorisk reaktion i perifera fettvävnad bidrar till typ 2 diabetes mellitus (T2DM) utveckling och aptitregleringen i hypotalamus. Chemokine CCL5 och C-C chemokine receptor typ 5 (CCR5) nivåer har föreslagits för att medla åderförkalkning och glukosintolerans vid typ 2 diabetes mellitus (T2DM). Dessutom roll CCL5 en neuroendokrina tumörer i hypotalamus genom att reglera mat intag och kroppstemperatur, således föranledde oss att undersöka dess funktion i hypotalamus insulin signalering och regleringen av perifera glukosmetabolism.
Micro-osmotic pump hjärnan infusionssystemet är ett snabbt och exakt sätt att manipulera CCL5 funktion och studera dess effekt i hjärnan. Det ger också ett bekvämt alternativ till generera en transgena knockout djur. I detta system blockerades CCL5 signalering av intracerebroventricular (ICV) infusion av dess antagonist, MetCCL5, använda en mikro-osmotic pump. Perifera glukos metabolism och insulin lyhördheten upptäcktes av Oral glukos tolerans Test (OGTT) och Insulin tolerans Test (ITT). Insulin signalerar aktivitet var sedan analyseras av protein blot från vävnadsprover som härrör från djur.
Efter 7-14 dagars MetCCL5 infusion, glukosmetabolism och insulin var lyhördhet nedsatt hos möss, som kan ses i resultatet av OGTT och ITT. IRS-1 serine302 phosphorylationen ökades och Akt aktiviteten minskades i möss hypotalamus nervceller efter CCL5 hämning. Sammantaget tyder våra data på att blockera CCL5 i mus hjärnan ökar fosforyleringen av IRS-1 S302 och avbryter hypotalamus insulin signalering, vilket leder till en minskning av insulinfunktion i perifera vävnader samt nedskrivning av glukos ämnesomsättningen.
Introduction
Insulin påverkar en mängd olika vävnader, inklusive hjärnan. Insulin passerar genom blod - hjärnbarriären, går in i det centrala nervsystemet (CNS) och binds med insulin receptor (IR) i hypotalamus att reglera matintag, sympatisk aktivitet och perifer insulinresistens svar. Kronisk inflammation i perifera fettvävnad har föreslagits att bidra till att typ 2 diabetes mellitus (T2DM), men hur dessa inflammatoriska reaktioner påverkar insulin signaler i hypotalamus att medla systemisk insulin svar och glukosintolerans oklar. Vissa chemokiner delta i aptitreglering och kroppens temperaturreglering i hypotalamus1 såsom tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα), interleukin (IL) -6, IL-1β, monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1 och andra) och CCL5 (C-C motiv ligand 5 ). Dessutom, leder inflammation i hypotalamus till insulinresistens i T2DM2,3.
Bland dessa chemokiner, förändring av uttrycksnivåerna för chemokine CCL5 och dess receptor, har CCR5, i fettvävnad associerats med åderförkalkning och glukosintolerans i T2DM i såväl människor som djur. CCL5 har också neuroendokrina funktionerna, inklusive regleringen av mat intag och kroppstemperatur, i hypotalamus. Det är därför viktigt att undersöka om CCL5 deltar i insulin signal aktiveringen inom hypothalamus eller perifera vävnader.
Insulin signalering är hårt reglerad inom celler. Bindningen av insulin till insulin receptorer (IR) aktiverar insulin receptor substrat (IRS) proteiner, följt av fosfatidylinositol 3-Kinas (PI3K) och protein kinase B (PKB/AKT) aktivering och glukos transporter-4 (GLUT4) membran translokation4 . IRS proteiner är viktiga tillsynsmyndigheterna i denna signalväg: de har flera tyrosin och serin restprodukter, som kan vara fosforyleras svar på positiva eller negativa insulin signaler5. Till exempel kan serine 302 fosforylering på IRS-1 leda till fysiska dissociationen av IRS-1 från IR och blockera insulin signaltransduktion, leder till insulin resistens6. Aktivitet nedskrivning av IRS proteiner i hypotalamus har visats inducera insulinresistens och glukosintolerans i möss7.
Ett vanligt sätt att studera funktionen av en specifik gen är manipulering av uttrycket av målgener fördelade över hela kroppen av organismen. Detta kan dock ha flera nackdelar: 1) det kan generera olika feedback föreskrivande eller kompensatoriska effekter över tid och (2) denna metod hjälper inte oss illustrera roll målproteinet i de delar av hjärnan. Även vävnad - och cell-specifika genen knockout djur ta lång tid att föda och är kostsamt. Således använder vi en kortsiktig hjärnan infusion osmotisk pumpsystem - ett relativt snabbt och bekvämt sätt att störa den signalering av målproteinet i hjärnan med hjälp av antagonist drogen för att övervinna de tidigare nämnda frågorna. Stereotaktisk injektioner används att kräva intrikata kirurgiska skicklighet och omfattande investeringar i instrumentering och tid. I detta protokoll ger vi ett enkelt och säkert sätt att utföra stereotaktisk injektion och en snabb, mindre skadliga och momentana metod att upptäcka koncentrationen av blodglukos och undersöka rollen som CCL5 i hypotalamus insulin signalering förordning.
Protocol
Obs: Alla protokoll och metoder används i animaliska ämnen har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC) i Taipei Medical University (protokoll nummer: LAC-2014-0387)
1. beredning av mikro-Osmotic pumpsystem för Infusion
Obs: Förbereder pumpen, konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) bufferten, och drogen (Met-CCL5/RANTES protein lösning (10 ng/mL i aCSF)) under sterila förhållanden med buffertar filtreras med 0,2 µm filter och genomför alla förfaranden under kultur huven med handskar. Ingrepp utförs enligt följande:
- Förbereda de mikro-osmotic pumparna en dag innan operation: Fyll hjärnan mikro-osmotic pumpen med konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) med en 1 mL spruta och blunt-head nål som tillhandahålls tillsammans med kitet. Fördjupa mikro-osmotic pumpen i aCSF och placera den på en shaker och skaka försiktigt över natten.
FÖRSIKTIGHET: Pumpen bör fyllas med aCSF och luftbubblor bör undvikas inuti pumpen (figur 1A). - Innan du börjar kirurgi, bereda rekombinant Met-CCL5/RANTES protein-lösning (10 ng/mL, utspädda i aCSF) som ska användas i försöket. Ta bort aCSF från pumpen och fyll pumpen med lösningen drog långsamt tills överskott läcker ut.
Obs: 15 mL aCSF eller Met-CCL5/RANTES lösning är tillräcklig för 5-8 pumpar.
FÖRSIKTIGHET: Upprepa proceduren för att säkerställa att pumpen är helt fyllt med drogen utan bubblor inuti. - Skär katetern rören i önskad längd och bifoga dem med blunt-end hjärnan infusion nålen i hjärnan infusion kit. Fyll Infusionset och rör med drogen.
- Slutligen, montera och fäst i hjärnan infusion kit mikro-osmotic pumpen.
Varning: Inga bubblor bör bildas i röret eller pumpen (figur 1A). - Sänk ner hela osmotisk pump-hjärnan fusion anges i aCSF i en steriliserad 50 mL tub att pumpen från att torka ut. Osmotisk pump-hjärnan är fusion nu redo att användas för kirurgi.
Obs: De mikro-osmotic pumpsystem kan användas för långsiktig drog infusion. Detta garanterar en säker och bekväm leveranssättet drog in i musen hjärnan.
2. intracerebralt ventrikulära kirurgi – implantation av micro osmotisk pumpen
FÖRSIKTIGHET: Sterilisera kirurgiska miljön med 75% etanol och se till att inblandade i studien bär sterila handskar och en ren labbrock. Kirurgiska verktyg / instrument måste vara autoklaveras och torkade innan användning, och därefter steriliseras med 75% etanol däremellan möss operationer.
- Väga musen och söva den med intra peritoneal injektion (IP) med ketamin/xylazin (ketamin 50 mg/kg, xylazin 10 mg/kg).
FÖRSIKTIGHET: Möss kroppsvikt lägre än 24 g rekommenderas inte för osmotisk pump implantation kirurgi. - Montera och fixa mus huvudet på stereotaktisk apparaten (figur 1B).
- Använd ett par kirurgiska saxar och tång för att skära öppna yttre huden som täcker skallen. Använda jod för att rengöra perifera skallen.
- Separera det yttersta lagret av huden från subkutan huden med hjälp av ett par blunt-head tång omkring hals regionen för osmotisk pump-hjärnan fusion inställda implantation (figur 1 c).
- Markera den infusion punkten med hänvisning till hjärnan kartan (figur 1 d) med hjälp av stereotaktisk apparaten. I detta experiment, nålen behöver implanteras i regionen 3rd ventrikeln (Bregma: 0.0 mm i sidled, 1,3 mm posteriort, 5,7 mm ventrala).
- Borra ett hål med en spik borr runt området märkt på skallen (figur 1E).
Varning: Var noga med att inte bryta musen hjärnhinnorna och blodkärl, därmed undvika störningar av mikro-blodkärlen i hjärnan. - Placera mikro-osmotic pump-hjärnan fusion Setet som innehåller aCSF (som kontroll) eller läkemedel (Met-CCL5/RANTES protein lösning) under huden bakom halsen regionen och infoga hjärnan infusionen nål in i det borrade hålet att ingjuta drogen i hjärnans mus ( Figur 1E). Nålen kommer tränga igenom hjärnhinnan och komma in i ventrikeln. Fixa nålen på plats på skallen använder surface okänsliggöra gel (figur 1F) och vänta 1-2 min tills limmet torkar. Nästa, skära av den utskjutande delen ovanpå nålen (figur 1 g- H).
- Använd en vävnad självhäftande lim för att läka operationen sår på huvudet. Tillsätt 50 µL utspätt lim ovanpå såret, dra båda sidor av huden ihop och håller på i 30 s för att låta huden att försegla (figur 1I).
Varning: Använd 100% alkohol pad för att rengöra såret efter operation och 100 ul penicillin med streptomycin att förhindra infektion. Obs: Mus hud kommer bildar ärrvävnad och läka på några dagar efter administrering av kirurgiska limmet. Den största fördelen med limmet är undvikandet av kirurgiska stygn som kan orsaka hudirritation eller inflammation. - Plats med musen i en ren bur förvaras på en varm tallrik (värms upp till 37 ° C) och vänta tills musen återhämtar sig från den anestetiska effekten.
Varning: Det är viktigt att upprätthålla musens kroppstemperatur för att öka chansen för överlevnad efter operationen. - Efter en veckas återhämtningsperiod, kommer att mössen vara redo för ytterligare experiment, såsom Oral glukos tolerans Test (OGTT) och Insulin tolerans Test (ITT).
3. oralt glukostoleranstest (OGTT)
Obs: Utföra den oralt glukostoleranstest 7 dagar efter infusion av aCSF och MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Upprätthålla ett 6 h snabb för möss innan OGTT med tillräcklig vattenförsörjning. Hålla djuren på bänken för samma arbete som där experimenten kommer att utföras så att de kan acklimatisera sig i miljön att minska stress under förfarandet.
- Glukos lösning förberedelse: innan du utför experimentet, förbereda glukoslösning genom upplösning 3.75 g glukos i 15 mL destillerat H2O.
- Ställa in en tidsplan att registrera avläsningarna under det experimentella förfarandet (tabell 1).
Obs: Det är viktigt att ställa in en tidsplan med rätt intervall mellan varje blod undersökning att tillåta korrekt inspelning under experimentet. - Väga varje mus efter fasta och beräkna lämplig mängd glukos som skall injiceras.
- Glukometer (tryck på startknappen kontrollera batteriets status, kontrollera att den fungerar innan testet.)
- Glukos-chip
- Insulinspruta (0,3 mL insulinspruta)
- Rakblad
- Timern
Obs: Glukos chipet kräver endast en droppe blod. När blodprovet behöver samlas mer än en gång, helt enkelt applicera tryck genom att köra fingrarna längs musens svans flera gånger medan du håller i slutet av svansen direkt ovanpå chipet att samla in blod. Det är inte nödvändigt att klippa svansen slutet varje gång medan samla blodprov.
4. insulin tolerans Test (ITT)
Obs: Insulin tolerans test- och oralt glukostoleranstest ska planeras minst 7 dagars mellanrum att minska fasta effekten på djur. För insulin tolerans test (ITT) administreras humant insulin (0,75 U/Kg) genom IP-injektion.
- Beredning av 0,25 U insulin lösning: Späd 100U humaninsulin förhållandet 1: 400 i saltlösning.
- Väga varje mus efter fasta, och beräkna den injicerade mängden insulin med detta: volym (µL) 0,25 U insulin ska injiceras IP = 3 X BW (0,75 U insulin/Kg kroppsvikt). Till exempel: för en mus väger 28,8 g, injicera: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U utspädd insulin) (tabell 2).
FÖRSIKTIGHET: Samma djur kan ha olika kroppsvikter efter 6 h fasta på olika dagar. Således är det nödvändigt att mäta kroppsvikt just före och efter fastan och beteende den OGTT och ITT testa. Musens kroppsvikt kunde släppa beroende på art, kön, och fastande varaktighet. Högre doser av insulin kan orsaka insulin chock och skulle leda till döden för djuret. - Ställa upp en tabell (tabell 2) att registrera avläsningarna under det experimentella förfarandet. Upprepa steg 3,4. till 3,8. för mätning blodglukosnivån.
Representative Results
Kirurgiska implantationer av osmotisk infusionspumpar som innehåller antingen aCSF som kontroll eller CCL5 antagonist MetCCL5 (att blockera CCL5 effekter i hjärnan) genomfördes på möss. 7 och 14 dagar efter operationen analyserades den perifera glukostolerans och insulin respons för möss med hjälp av OGTT (efter 7 dagar) och ITT (efter 14 dagar) som nämns i protokollet. Den oral glukostoleranstest (OGTT) och insulin tolerans test (ITT) av möss utfördes efter 6 timmar fasta. Möss administrerades med glukos oralt, med det belopp som baseras på deras respektive kroppsvikter. Förändringar i blodsockernivåerna registrerades, som visas i figur 3. Det insulin känslighet testet utfördes av intraperitoneal (IP) insulin injektion i möss och ändringen av blodsockernivå mättes omedelbart. Ändringarna av glukos i blodet vid insulin stimulering i möss med olika infusion droger registrerades, som visas i figur 4. Blodglukosnivån minskade endast marginellt efter glukos administration (figur 3B) och insulin injektion (figur 4B) hos möss med CCL5 antagonist (MetCCL5) infusion jämfört med möss med aCSF infusion. Dessa resultat tyder nedskrivningar i insulinfunktion på perifera glukosmetabolismen i möss med MetCCL5 administreras i hjärnan.
Nästa, vi analyserat aktivering av insulin signal genom att utvärdera de IRS-1 fosforylering och Akt aktiveringen nivåer i hypotalamus vävnader. Serine phosphorylationen på 302 för IRS-1 var uppreglerad i möss som behandlats med antagonist (MetCCL5) (figur 5B-C) när möss matades normalt. I kontrollgruppen var aCSF administreras till möss hypotalamus och insulin utmaningen aktiveras downstream signalera molekylen Akt (fosforyleras Akt Serine 473) (figur 5 d, F) utan att öka IRS-1 serine302 aktivering () Figur 5 d -E) och Akt serine473 fosforylering. Däremot Akt signalen ökade inte hos möss infunderas med MetCCL5, men det var en ökning av fosforylering av IRS-1 serine 302 istället. Samtidigt avbryts blockerar CCL5 signalen i mus hjärnan insulin aktivitet i hypotalamus och nedsatt perifer insulinresistens funktion. Från våra övergripande resultat, såsom resultat från ITT, OGTT och ex vivo insulin utmaning, vi drog slutsatsen att CCL5 i hypotalamus bidrar till insulin signal aktivering och perifera glukosmetabolism vid insulin stimulering.
Figur 1. Osmotisk pump förberedelse och implantation kirurgiskt ingrepp i mus. (A), hjärnan infusionen kit och pump beredning perfusion med drogen lösning. Röda pilarna visar katetern rören fyllda med vätska. (B) Fix och mount mus huvudet på stereotaktisk apparaten. (C) separat det yttersta lagret av huden från subkutan huden för implantation av mikro-osmotic pump-hjärnan infusionsset; Dash linjerna indikerar platsen för osmotisk pump implantat. (D), pilen visar den infusion sidan. (E) borra ett hål runt det markerade området på skallen. (F) plats osmotisk pump-hjärnan infusion in i baksidan av musen och in hjärnan infusion nålen i det borrade hålet (bindestreck inringad). (G) fixa på injektionsnålen på skallen med vävnad självhäftande lim och lossa toppen av nålen (Scissor pekade i G) som visas i (H). (jag) tätning av såret med vävnad klister. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa bilder av området drog diffusion när läkemedlet administreras i regionen ventrikulära osmotisk pumpen. Evan's blue är den representativa drogen som används i bilden osmotisk pumpen drog infusion in i ventrikulära regionen (A) och diffusion i laterala och tredje ventriklarna (B). Skalstapeln = 0,5 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Glukosmetabolism hos möss efter kirurgi mätt den oralt glukostoleranstest (OGTT). Fördelningen av blodsockernivåerna förändrats efter oral administrering av glukos i WT möss infunderas med aCSF (A) och antagonist, MCCL5 (B). Data visas som medelvärde ± SE. (figur modifierad från8). * p < 0,05, av tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Insulinfunktion i möss blodglukos - insulin tolerans test (ITT). Fördelningen av blodsockernivåerna förändrats efter insulininjektionen i WT möss infunderas med aCSF (A), och infunderas med antagonist, MCCL5 (B). Data presenteras som medelvärde ± SE (figur modifierad från8). p < 0,001, av tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Insulin signalerar aktivitet hos möss efter kirurgi. (A) Western blotting av hämmande Serine 302 fosforylering form av IRS-1 (insulin svar substrat-1, pIRS1S302) i möss hypotalamus vävnader behandlas med aCSF eller CCL5 antagonist, MetCCL5 (MCCL5) infusionspump. (B) relaterade nivåer av fosfor-IRS-1S302 efter infusion i möss hypothalamus med normal utfodring.(C) Western blotting av S302 fosforyleringen av IRS-1 och Akt aktivering (fosfor-Akt S473, pAktS473) med eller utan insulin stimulering i hypotalamus vävnad efter aCSF eller METCCL5 infusion. (D-E) Relativa nivåer av pIRS-1S302, pS6KT421och pAktS473. (”2” i varje stapeldiagram står för: n = 2 för alla kvantifieringar). (Tom staplarna i 5D-E, vänster: utan insulin; remsor barer i 5D-E, höger: med insulin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| # | Mus-ID | Kroppen | Glukos | Starta | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| vikt | ΜL = 10xBW | tid | mins | mins | mins | mins | mins | ||
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
Tabell 1. Tidtabell för Oral glukos tolerans Test (OGTT) inspelning
| # | Mus-ID | Kroppen | Insulin 0,25 IE | Starta | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| vikt | ΜL = 3xBW | tid | mins | mins | mins | mins | mins | ||
| 1 | 501 | 28.8g | 86,4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 75,9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
Tabell 2. Tidtabell för Insulin tolerans Test (ITT) inspelning
Discussion
Mekanismen av kronisk inflammation och relaterade chemokiner såsom CCL5 och dess receptor – oklar CCR5 i utvecklingen av typ 2-diabetes. Kronisk inflammation orsakar makrofag infiltration i fettvävnad och påverkar regleringen av adipokines; under tiden, det också lockar β-celler och försämrar insulinutsöndringen från de Langerhanska öar som svar på blodsockret. Hypotalamus i hjärnan spelar en viktig roll som en ledningscentral i samordningen av insulin och adipokine signaler från de systemiska perifera vävnaderna reglera aptit, perifert blod glukosmetabolism och insulin svar. Många studier visar också att hypotalamus inflammation leder till defekt reglering av energi homeostas och defekta bukspottskörteln holme samt leverfunktionen2,3,9,10. CCL5 i hjärnan bidrar till mat intag och kroppens temperaturreglering i hypotalamus11,12; CCL5 korrelation till hypotalamus och systemisk insulin signalering är dock oklart. En CCL5 hela kroppen knockoutmus (CCL5- / -) har skapats för att hantera denna fråga, som visar en insulin resistens fenotyp med högre insulinnivåer och höga blodsockernivåer i blodet8. Men det kräver lång tid att utveckla T2DM fenotypen och det är svårt att undersöka roll och mekanismen av CCL5 i hypotalamus insulin signalen på grund av eventuella kompenserande långtidseffekter. En direkt manipulation av CCL5 signalering i hypotalamus nervceller är därför det bästa tillvägagångssättet. Dock finns det flera typer av nervceller i hypotalamus regionen och det är ganska dyrt och tidskrävande att generera cell specifika knockoutmöss. Utnyttja en ICV kan infusionssystem därmed spara tid och ge en mer specifik strategi för att manipulera CCL5 funktion direkt i hjärnan, kringgå eventuella perifera inflammatoriska reaktioner.
Studier utnyttjar osmotisk pumpar har redan publicerats tidigare, att ge bra exempel och demonstrationer av tekniker som används i implantation av osmotisk pumpar i gnagare13. Vi emellertid inför några utmaningar när du följer dessa protokoll i vår studie. Första del av den utrustning som används i protokollet är ganska dyra, inklusive (1) det elektriska systemet för att nå den platsen, rita och lägga nålen in mus hjärnan, 2) thermo systemet för att upprätthålla mus kroppstemperatur och 3) den syre-isofluran leverera system för att administrera anestesi till möss. Andra var metoder som beskrivs i andra artiklar svåra att replikera, eftersom vi kunde endast använda djur inom ett litet utbud av kroppsvikter och i vissa åldrar för vår studie. Vi är medvetna om att större möss är mer lämpade för kirurgi och implantation. I vår studie, hade vi dock att använda mindre och yngre möss för att undvika övervikt och åldrande effekter på insulin och blod glukos förordning: bara manliga möss med kropp vikt 25 ± 2 g och ålder cirka 2 månader gammal valdes i studien. Det är således svårt att utföra kirurgi och sutur såret på mus huvudet. Tredje, den inflammatoriska responsen har minimeras efter operation eftersom en inflammatorisk cytokin är målet i denna studie. Möss och råttor kan ta bort suturen och enkelt öppna sår efter operation, vilket kommer att resultera i inflammation och öka chemokine reaktioner. Därför behövs en strategi för att nå platsen och rita och stick in nålen i mus hjärnan som undviker sekundär infektion. Därför, vi ändrade de tidigare beskrivna protokoll för att göra denna teknik kostnadseffektiva, lättare och mindre skadliga för djuren, som beskrivs i följande stycke.
För det första, vi brukade en spik borr manuellt borra ett hål runt målområdet märkt på skallen, som beskrivs i steg 2,6. Denna metod är kostnadseffektivt och ger oss möjlighet att övervaka hela förfarandet för att undvika skada mus hjärnhinnorna och blodkärl. Blod glukos reglering är nedsatt efter akut stroke, till exempel en blödning i hjärnan. Akut hyperglykemi och diabetes-liknande syndrom observerades också efter stroke i kliniska inställningar14,15. Dessutom hittade vi också nedsatt glukos nivå och insulin svar i möss med blödning och pus i hjärnan. Vi är medvetna om att bättre kontroll av manuell-baserade kirurgi är nödvändiga för att säkerställa konsekvens av resultaten. För det andra tog vi fördel av en nyutvecklad medicinsk biomaterial som vanligen används på kliniker, vävnad klister (steg 2,8), för att täta huden på mus huvudet efter operation, därför undvika sömmar och påskynda graden av healing. Detta gör kirurgiska ingrepp lättare att utföra och minskar risken för sekundär inflammation. För det tredje, den tid som krävs för att utföra hela ingreppet är jämförelsevis kortare, vilket ökar chansen för överlevnad för möss och sänker doseringen av anestetiska läkemedel som injiceras intraperitonealt. Vi observerade en hög överlevnad (95%) och fick relativt träffsäkra resultat genom att följa detta modifierade protokoll.
Begränsning av denna teknik är den relativt kort tidsramen av drogen leverans. Även om en osmotisk pump kan placeras in i musen kroppen alternativt utan återöppnande hjärnan, vår studie endast fokuserar på inflammatoriska chemokine effekten på hjärnan att reglera den perifera systemiska insulin signalering. Ytterligare kirurgi i perifera vävnader kan eventuellt framkalla en inflammatorisk reaktion i perifera vävnader, som sedan skulle öka inflammatoriska chemokine uttryck och påverka resultatet. För det andra, halveringstiden för läkemedlet också begränsar varaktigheten av studien. Rekombinanta proteiner såsom chemokine har oftast en kortare halveringstid, som förlorar sin verksamhet över tid, även om det också tillåter oss att studera effekten av blockerande CCL5 signalering i hjärnan på kort sikt. Våra tidigare studier har också beskrivit en genetisk modifiering metod för att generera en CCL5 knockoutmus, vilket ger en modell med långsiktiga effekter8.
Det finns några nya tekniker och alternativa metoder att leverera läkemedel till hjärnan. Nanotekniken är en kraftfull teknik, som kan användas för att leverera läkemedel till det centrala nervsystemet. Men många droger är värmekänslig och kan förstöras när du försöker paketera dem i nanopartiklar16. Dessutom nanopartiklar kan passera BBB och vara uptaken av celler som är lämpliga för siRNA eller vanligaste droger, men det är inte en idealisk metod för ligand-receptorbindning.CCL5 kräver bindning till sin receptor, CCR5, i hypotalamus ARC nervceller att ta effekt8, och leverans av CCL5 antagonist MetCCL5 i nervceller genom nanopartiklar kan orsaka en förlust av förmågan att binda och blockera CCR5 på cellen yta.
Blodglukosnivån var signifikant högre hos möss som administreras med den CCL5-antagonist MetCCL5 jämfört med kontroller (möss administrerades med aCSF) i den oralt glukostoleranstest. Extra insulin administration (insulin tolerans test) har också kunnat sänka blodglukosnivån i MetCCL5 emot möss (figur 4B), vilket tyder på att både kroppsegna och externa insulin inte kan minska blodsockernivåerna När blockerar hypotalamus CCL5 signalering. Möss blev insulinresistenta utan CCL5 aktivitet i hypotalamus. Ökad serine302 fosforylering av IRS-1 hittades i möss som fick Met-CCL5 jämfört med kontroll möss som fick aCSF (figur 5A-B). Serine 302 fosforylering av IRS-1 har visats inducera en fysisk dissociation av IRS-1 från det insulin receptor, som är en viktig orsak till insulin resistens6; insulin är inte aktivera nedströms signaler såsom PI3K-Akt vägen. En stimulering ex vivo insulin studie bekräftade insulinet nedströms signalmolekyl Akt (p-AktS473) inte aktiverades av insulin i mus hypotalamus vävnad infunderas med Met-CCL5 och istället serine 302 phosphorylationen ökade. Helt och hållet, både fysiologiska data (OGTT och ITT) och molekylär studie visar att hypotalamus CCL5 signalering förmedlar hypotalamus insulin signal förordningen, vilket bidrar till systematisk insulin resistens och glukos metabolism.
Roll och mekanismen av CCL5 och CCR5 i fetma-associerade diabetes är fortfarande oklart. Kitade et al. rapporterade att CCR5-brist skyddade möss från fetma-inducerad inflammation, makrofag rekrytering och insulin resistens17. Andra studier av Kennedy et al. visade dock motsatta resultat som visar att CCR5-brist försämrar systemisk glukostolerans liksom fettceller och muskel insulin signalering18. Båda studierna tillämpas en fettrik diet för att inducera fetma, vilket leder till kronisk inflammation i hela kroppen och kompensatoriska svar. Dessa studier tillhandahöll inte rena och klara mekanismer för CCL5 och CCR5 i insulin signalering förordning. Däremot, osmotisk pumpen tekniken tillåter en hjärna särskilda infusion och undviker kompensatoriska svar med dess tidsbegränsad leverans.
Sammanfattningsvis, även om osmotisk pumpen med hjärnan infusionssystemet verkar vara en ”gammaldags” teknik, den ger en billigare, lättare och mindre skadliga leveranssätt drog och hjälper undersöka funktionen av ligand-receptor signalering i den hjärnan.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att stöds från ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) och Socialstyrelsen avgiftsbelagd för tobaksvaror - MOHW106-TDU-B-212-144001 till S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
