Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes
Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour quantifier l’agrégation des protéines mal repliées. Les détails de notre protocole des gènes induits par cellulaires stables ligne génération automatisée d’imagerie confocale et analyse d’image des agrégats de protéine. Comme application illustrative, nous avons étudié l’effet de petites molécules dans la promotion de SOD1 agrégation en temps – et dose-dépendante.
Abstract
Sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative mortelle qui peut être causée par des mutations dans la gène codant cuivre-zinc superoxyde-dismutase 1 (SOD1) héréditaires. L’instabilité structurelle du SOD1 et la détection des inclusions SOD1 positifs chez les patients familial-ALS prend en charge un rôle causal pour SOD1 mal repliées ou agrégées en pathologie de l’ALS. Dans cette étude, nous décrivons le développement d’un test d’amplification cellulaire conçu pour quantifier la dynamique d’agrégation SOD1 dans les cellules vivantes par la haute teneur en approches de dépistage. À l’aide de vecteurs LENTIVIRAUX, nous avons généré des lignées stables exprimant sauvage et mutantes A4V SOD1 tag protéine fluorescente jaune et a conclu que les deux protéines ont été exprimés dans le cytosol sans aucun signe d’agrégation. Fait intéressant, seulement SOD1 A4V stablement exprimée en HEK-293, mais pas dans les lignées cellulaires U2OS ou SH-SY5Y, forment des agrégats par traitement inhibiteur du protéasome. Nous montrons qu’il est possible de quantifier d’agrégation basée sur l’analyse de la relation dose-réponse de divers inhibiteurs du protéasome et pour suivre la cinétique de la formation d’agrégats par microscopie Time-lapse. Notre approche introduit la possibilité de quantifier l’effet des mutations ALS sur le rôle de SOD1 dans la formation globale ainsi que de dépistage pour les petites molécules qui empêchent l’agrégation SOD1 A4V.
Introduction
Agrégation des protéines est un processus biologique par lequel pliée groupe de protéines vers le haut et peuvent agir comme agents responsables de maladies neurodégénératives (amylose). Caractériser l’agrégation des protéines est essentiel pour comprendre le rôle des agrégats en dysfonctionnement cellulaire ainsi qu’en facilitant la découverte de nouveaux facteurs qui influent sur l’apparition de la pathologie. La visualisation de protéines marquées fluorescence dans les cellules vivantes est une méthode puissante qui peut aider à l’élaboration d’essais applicables à haute teneur de dépistage (HCS)1,2,3,4.
Sclérose latérale amyotrophique (SLA) est considérée comme une maladie proteopathic causée par la présence de protéines mal repliées à la propension d’agréger et de s’accumuler dans les motoneurones en ALS familiales (fALS) et sporadiques ALS (sALS)5,6 . Un sous-ensemble de ~ 20 % des cas de fALS sont associées avec des mutations dominantes du gène codant l’enzyme cytosolique antioxydant dismutase de superoxyde cuivre-zinc de type 1 (SOD1)7,8. Plusieurs causes possibles de ce dysfonctionnement génétiquement dérivé ont été proposés, y compris les changements dans la structure et la fonction des variantes SOD1, comme la stabilité aberrante, augmentation du rythme qui se déroule et propension au total9, 10. Notamment, la seule propriété vérifiée et potentiellement toxique partagé par les deux variantes de ALS-linked SOD1 et sauvage (WT) SOD1 est une propension accrue à former des agrégats de protéine compartimentée ou inclusions protéiques11,12 . Mal repliée mutant SOD1, est constamment polyubiquitinée et dégradés par le système ubiquitine-protéasome. Ainsi, un faible taux d’inhibition de l’activité du protéasome conduit à l’accumulation du mutant que SOD1 regroupe13,14, quelles structures de forme amorphe comprenant d’éléments solubles qui peuvent échanger avec soluble mutant SOD1 dans le cytosol15. En particulier, SOD1 mutant A4V (alanine au codon 4 remplacé par la valine) est la plus commune mutation causant des ALS et mène à la neurodégénérescence rapide avec un temps de survie moyen de moins de 2 ans après l’ apparition de la maladie16. Biochimiquement, SOD1 A4V a une tendance accrue à la monomerize, agréger et former des pores amyloïdes ; ses pores comme agrégats ressemblent aux pores amyloïdes d’autres formes mutantes liées à la maladie, comme la synucléine α et β-amyloïde protéine17. Afin d’étudier la dynamique de l’accumulation de SOD1-granulat, méthodes de surveillance solubles et insolubles SOD1 formes restent à être développé.
Nous avons déjà montré, en utilisant l’imagerie de cellules vivantes et cellules HEK-293 transfectées de manière transitoire avec fluorescent protein-tag SOD1, que les mutations associées à ALS atteinte SOD1 dimérisation et agrégation11. Bien que les systèmes d’expression transitoire peuvent fournir des informations utiles sur les résultats biologiques de la surexpression de gène à court terme, qui fournit une intégration stable des gènes désirés peut être préférable pour le développement de l’analyse. Par conséquent, vecteurs LENTIVIRAUX offrent la possibilité de conférer à l’expression des gènes à long terme et réglementé sur cellules de mammifères, 18. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la génération des lignées cellulaires stables transduites avec recombinants lentivirus portant WT et mutant SOD1 estampillés de la protéine fluorescente jaune (YFP). À l’aide de la microscopie imagerie de cellules vivantes et quantification automatisée d’agrégation SOD1, nous avons déclenché et quantifié SOD1 événements d’agrégation sur l’inhibition du protéasome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe deux approches principales pour générer des lignées cellulaires stables. Le premier prend plusieurs semaines et nécessite transitoire sélection de transfection et la résistance des vecteurs ADN génomique plasmidique intégré. Le second tire quelques heures grâce à l’utilisation de lentivirus, ce protocole se prêtent à l’expression efficace de protéine cible dans plusieurs lignées cellulaires avec peu d’effort. Le voyage-CMV vecteur19 était un vecteur soutenu à utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention financée par le gouvernement coréen (MSIP) (FRO-2014K1A4A7A01074642) et le programme de soutien individuel scientifique National Research Foundation de Corée (NRF) (FRO-2013M3A9B5076486/FRO-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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