Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi
Summary
Descriviamo un metodo per quantificare l’aggregazione delle proteine misfolded. I nostri dettagli di protocollo lentivirali indotto generazione linea cellulare stabile, imaging confocale automatizzata e l’analisi di immagine di aggregati proteici. Come un’applicazione illustrativa, abbiamo studiato l’effetto di piccole molecole nel promuovere l’aggregazione di SOD1 nel tempo – e dose-dipendente.
Abstract
Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è una malattia neurodegenerative mortale che può essere causata da mutazioni ereditarie nel gene codifica dello rame-zinco superossido dismutasi 1 (SOD1). L’instabilità strutturale della SOD1 e il rilevamento delle inclusioni di SOD1-positivi nei pazienti di ALS familiare supporta un potenziale ruolo causale per SOD1 misfolded e/o aggregate in patologia di ALS. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di un’analisi basata su celle progettato per quantificare la dinamica di SOD1 aggregazione in cellule viventi di alto contenuto approcci di screening. Utilizzo di vettori lentivirali, abbiamo generato linee cellulari stabili che esprimono wild-type e mutante SOD1 A4V etichettati come proteina fluorescente gialla e trovato che entrambe le proteine sono state espresse nel citosol senza alcun segno di aggregazione. È interessante notare che, solo SOD1 A4V stabilmente espressa in HEK-293, ma non in linee cellulari di U2OS o SH-SY5Y, formano aggregati al trattamento con un inibitore del proteasoma. Mostriamo che è possibile quantificare aggregazione basata sull’analisi di dose-risposta di vari inibitori del proteosoma e per tenere traccia di cinetica di formazione di aggregati da microscopia time-lapse. Il nostro approccio introduce la possibilità di quantificare l’effetto delle mutazioni ALS sul ruolo della SOD1 nella formazione di aggregati così come screening per piccole molecole che impediscono l’aggregazione A4V SOD1.
Introduction
L’aggregazione di proteine è un processo biologico mediante il quale misfolded gruppo di proteine fino e può agire come agenti causativi nelle malattie neurodegenerative (amiloidosi). Che caratterizzano l’aggregazione proteica è essenziale nella comprensione del ruolo degli aggregati in disfunzione cellulare anche come facilitare la scoperta di nuovi fattori che influenzano l’insorgenza della patologia. La visualizzazione delle proteine fluorescenza-etichettate in cellule viventi è un metodo potente che può essere di aiuto nello sviluppo di saggi applicabili al contenuto elevato di screening (HCS)1,2,3,4.
Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è considerata come una malattia proteopathic causata dalla presenza di proteine misfolded con la propensione ad aggregare e si accumulano in motoneuroni ALS familiare (fALS) sia sporadico di ALS (SLAs)5,6 . Un sottoinsieme di ~ 20% dei casi di fALS sono associati con le mutazioni dominanti nel gene che codifica per l’enzima antiossidante citosolico rame-zinco superossido dismutasi di tipo 1 (SOD1)7,8. Sono state proposte diverse possibili cause per questa disfunzione geneticamente derivata, compreso i cambiamenti nella struttura e nella funzione di SOD1 varianti, quali stabilità aberrante, tasso aumentato di spiegamento e propensione all’aggregazione9, 10. In particolare, l’unica proprietà verificata e potenzialmente tossico condiviso da entrambe le varianti di ALS-collegato SOD1 e wild type (WT) SOD1 è una tendenza aumentata a formare aggregati proteici compartimenti o inclusioni proteiche11,12 . Misfolded mutante SOD1, é costantemente poliubiquitinate e degradato dal sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, un basso livello di inibizione del proteasoma conduce all’accumulazione del mutante che SOD1 aggrega13,14, quali strutture amorfe di forma è composta da componenti solubili che possono scambiare con SOD1 mutante solubile nel citosol15. In particolare, SOD1 mutante A4V (alanina a codone 4 cambiato a valina) è la mutazione più comune causa di ALS e conduce alla neurodegenerazione di tipo rapido con un tempo di sopravvivenza medio di meno di 2 anni dopo la malattia inizio16. Biochimicamente, SOD1 A4V ha un’aumentata tendenza al monomerize, aggregare e formare pori dell’amiloide; i poro-come i complessi sono simili a pori dell’amiloide di altre forme mutanti legate alla patologia, come α-synuclein e β-amiloide proteina17. Per studiare la dinamica di accumulo di SOD1-aggregato, metodi per il monitoraggio solubili e insolubili forme di aggregazione SOD1 rimangono per essere sviluppato.
Precedentemente abbiamo indicato, usando la formazione immagine di cellule vive e cellule HEK-293 transfected transitoriamente con fluorescente contrassegnati proteina SOD1, che mutazioni associate a ALS alterano SOD1 dimerizzazione e aggregazione11. Anche se i sistemi di espressione transiente possono fornire utili informazioni circa l’esito biologico della sovraespressione genica a breve termine, metodi fornendo integrazione stabile dei geni desiderati possono essere preferiti per sviluppo di analisi. Come tale, vettori lentivirali offrono la possibilità di conferire l’espressione genica a lungo termine e regolata su cellule di mammifero 18. In questo studio, ci siamo concentrati sulla generazione di linee cellulari stabilizzate trasformata con lentivirus ricombinanti WT del cuscinetto e mutante SOD1 contrassegnati con la proteina fluorescente gialla (YFP). Utilizzando cellule vive imaging microscopia e quantificazione automatizzata dell’aggregazione di SOD1, abbiamo attivato e quantificato SOD1 tra gli eventi di aggregazione all’inibizione del proteasoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono due approcci principali per la generazione di linee cellulari stabili. Il primo richiede parecchie settimane e selezione di transfezione e resistenza transitoria dei vettori di DNA genomico plasmide integrato. Il secondo prende una questione di ore attraverso l’uso dei lentivirus, rendendo questo protocollo suscettibili dell’efficace espressione di proteina bersaglio in linee cellulari multiple con sforzo limitato. Il viaggio-CMV vettore19 era un vettore di sostenuta da utilizzare, con eff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) e il programma di supporto individuale scienziato National Research Foundation di Corea (NRF) (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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