उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव
Summary
हम एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रकट प्रोटीन का एकत्रीकरण मात्रा । हमारे प्रोटोकॉल विवरण lentiviral प्रेरित स्थिर सेल लाइन पीढ़ी, स्वचालित फोकल इमेजिंग, और प्रोटीन समुच्चय की छवि विश्लेषण । एक उदाहरण के आवेदन के रूप में, हम एक समय में SOD1 एकत्रीकरण को बढ़ावा देने में छोटे अणुओं के प्रभाव का अध्ययन किया और खुराक-निर्भर तरीके से.
Abstract
पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) एक घातक neurodegenerative रोग है कि जीन एंकोडिंग तांबा-जस्ता सुपरऑक्साइड dismutase 1 (SOD1) में विरासत में उत्परिवर्तनों के कारण हो सकता है । SOD1 की संरचनात्मक अस्थिरता और SOD1-एस रोगियों में सकारात्मक समावेश का पता लगाने के लिए एक संभावित कारण भूमिका का समर्थन करता है और एस विकृति विज्ञान में समग्र SOD1 । इस अध्ययन में, हम उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण से जीवित कोशिकाओं में SOD1 एकत्रीकरण की गतिशीलता को बढ़ाता है एक सेल आधारित परख के विकास का वर्णन । lentiviral वैक्टर का उपयोग करना, हम स्थिर सेल जंगली प्रकार व्यक्त लाइनों और उत्परिवर्ती A4V SOD1 पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग की गईं और पाया कि दोनों प्रोटीन एकत्रीकरण के किसी भी हस्ताक्षर के बिना cytosol में व्यक्त किया गया था उत्पंन । दिलचस्प है, केवल SOD1 A4V छुरा HEK-२९३ में व्यक्त की है, लेकिन U2OS या एसएच SY5Y सेल लाइनों में नहीं, proteasome अवरोध करनेवाला उपचार पर समुच्चय का गठन किया । हमें पता चलता है कि यह खुराक के आधार पर एकत्रीकरण करने के लिए संभव है-विभिन्न proteasome अवरोधकों की प्रतिक्रिया विश्लेषण, और समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कुल गठन कैनेटीक्स ट्रैक करने के लिए. हमारे दृष्टिकोण कुल गठन में SOD1 की भूमिका पर एस उत्परिवर्तनों के प्रभाव को बढ़ाता है और साथ ही छोटे अणुओं है कि SOD1 A4V एकत्रीकरण को रोकने के लिए स्क्रीनिंग की संभावना का परिचय ।
Introduction
प्रोटीन एकत्रीकरण एक जैविक प्रक्रिया है जिसके द्वारा प्रोटीन समूह अप और neurodegenerative रोगों (amyloidosis) में प्रेरणा का एजेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं । निस्र्पक प्रोटीन एकत्रीकरण सेलुलर रोग में समुच्चय की भूमिका को समझने में के रूप में अच्छी तरह के रूप में नए कारकों है कि विकृति की शुरुआत को प्रभावित की खोज को सुविधाजनक बनाने में आवश्यक है । प्रतिदीप्ति के दृश्य-कोशिकाओं में रहने वाले प्रोटीन टैग उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS)1,2,3,4के लिए लागू परख के विकास में सहायता कर सकते है जो एक शक्तिशाली तरीका है ।
पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) समग्र करने के लिए प्रवृत्ति के साथ एक प्रकट प्रोटीन की उपस्थिति के कारण एक proteopathic रोग के रूप में माना जाता है और दोनों पारिवारिक एस (fALS) और छिटपुट एस में मोटर न्यूरॉन्स में जमा (sALS)5,6 . fALS मामलों के ~ 20% का एक सबसेट जीन cytosolic एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम तांबा-जस्ता सुपरऑक्साइड dismutase प्रकार 1 (SOD1)7,8एंकोडिंग में प्रमुख उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े रहे हैं । इस आनुवंशिक रूप से व्युत्पंन शिथिलता के लिए कई संभावित कारणों का प्रस्ताव किया गया है, संरचना और SOD1 वेरिएंट के समारोह में परिवर्तन सहित, जैसे ंयायपालिका स्थिरता, बढ़ खुलासा दर, और कुल करने के लिए प्रवृत्ति9, 10. विशेष रूप से, केवल सत्यापित और संभावित विषाक्त दोनों एस-लिंक्ड SOD1 वेरिएंट और जंगली प्रकार (WT) द्वारा साझा संपत्ति SOD1 compartmentalized प्रोटीन समुच्चय या proteinaceous समावेशन के रूप में एक वृद्धि की प्रवृत्ति है11,12 . reSOD1ed उत्परिवर्ती, लगातार polyubiquitinated है और ubiquitin-proteasome प्रणाली द्वारा नीचा । नतीजतन, proteasome गतिविधि के निषेध के एक निम्न स्तर के उत्परिवर्ती SOD1 समुच्चय के संचय की ओर जाता है13,14, जो अमली रूप से घुलनशील घटकों से बना संरचनाओं के फार्म का है कि घुलनशील उत्परिवर्ती के साथ आदान प्रदान कर सकते हैं SOD1 cytosol15में । विशेष रूप से, SOD1 उत्परिवर्ती A4V (4 codon में alanine वैलिन को बदल दिया) सबसे आम एस उत्परिवर्तन के कारण है, और एक औसत से कम 2 साल के अस्तित्व के समय के साथ तेजी से neurodegeneration की ओर जाता है रोग की शुरुआत के बाद16। जैव रासायनिक, SOD1 A4V monomerize, कुल के लिए एक वृद्धि की प्रवृत्ति है, और फार्म amyloid pores; इसकी ताकना की तरह समुच्चय अंय रोग के amyloid pores जैसे α-synuclein और β-amyloid17प्रोटीन के रूप में, जुड़े उत्परिवर्ती रूपों, के समान हैं । SOD1-समग्र संचय की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, घुलनशील और अघुलनशील SOD1 समग्र रूपों की निगरानी के लिए तरीके विकसित किए जाने के लिए रहते हैं ।
हम पहले से दिखाया है, लाइव सेल इमेजिंग और HEK-२९३ कोशिकाओं क्षणिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ transfected-SOD1 टैग का उपयोग कर, कि एस-जुड़े उत्परिवर्तनों SOD1 dimerization और एकत्रीकरण11ख़राब । हालांकि क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली अल्पकालिक जीन एक्सप्रेस के जैविक परिणाम के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, वांछित जीन के स्थिर एकीकरण उपलब्ध कराने के तरीकों परख विकास के लिए पसंद किया जा सकता है । जैसे, lentiviral वैक्टर स्तनधारी कोशिकाओं 18पर दीर्घकालिक और विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रदान करने की क्षमता प्रदान करते हैं । इस अध्ययन में, हम स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित संयोजक lentivirus असर WT और उत्परिवर्ती SOD1 पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के साथ टैग के साथ transduced । SOD1 एकत्रीकरण के लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी और स्वचालित ठहराव का उपयोग करना, हम ट्रिगर और proteasome के निषेध पर SOD1 एकत्रीकरण की घटनाओं मात्रा ।
Protocol
1. Lentivirus उत्पादन
नोट: lentiviral वैक्टर के उत्पादन और हेरफेर बाहर किया गया था के अनुसार राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थान (NIH) को शामिल अनुसंधान के लिए दिशानिर्देश संयोजक डीएनए. प्लाज्मिड एंकोडिंग जंग…
Representative Results
Discussion
स्थिर कक्ष रेखाएँ जनरेट करने के लिए दो मुख्य पहुँच हैं । पहले कई हफ्तों लेता है और जीनोमिक एकीकृत प्लाज्मिड डीएनए वैक्टर के क्षणिक अभिकर्मक और प्रतिरोध चयन की आवश्यकता है । दूसरा lentivirus के उपयोग के माध्य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरियाई सरकार (MSIP) (एनआरएफ-2014K1A4A7A01074642) द्वारा वित्तपोषित अनुदान द्वारा समर्थित था, और कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) व्यक्तिगत वैज्ञानिक सहायता कार्यक्रम (एनआरएफ-2013M3A9B5076486/एनआरएफ-2015R1D1A1A09057239) ।
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
