Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.
Abstract
Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell’osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l’influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l’attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.
Introduction
Dell’osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici1. L’equilibrio tra la formazione dell’osso e riassorbimento dell’osso è cruciale per salute dell’osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell’osso, compreso l’osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic dell’osso supera l’osso formando la capacità di osteoblasti2,3. Così, al fine di sviluppare obiettivi farmaceutici per il trattamento di patologie ossee come l’osteoporosi, è fondamentale per capire la generazione e la biologia di osteoclasti4.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleated giganti uniche situate in o vicino alla superficie dell’osso e appartengono alla famiglia del monocito/macrofago1. Ibbotson K. J. et al. segnalato un metodo per generare osteoclast-come le cellule in vitro con mezzo contenente 1,25-diidrossi-vitamina D35. L’identificazione del fattore di stimolazione della macrofago-colonia (M-CSF) e attivatore del recettore per il ligando di nuclear factor-κ B (RANKL) come fattori essenziali della formazione degli osteoclasti è aumentato drammaticamente l’efficienza di osteoclastogenesi in vitro 1 , 6 , 7. la capacità di cultura osteoclasti in vitro ha migliorato la nostra comprensione della generazione e regolamento degli osteoclasti.
La destinazione dei mammiferi/meccanicistica rapamycin (mTOR) funzioni in due complessi strutturalmente e funzionalmente distinte, vale a dire mTORC1 e mTORC28,9. I due complessi della multi-proteina sono distinti gli uni dagli altri a causa dei loro diversi componenti e substrati a valle. mTORC1 contiene la proteina unica regolamentazione-collegata di mTOR (Raptor), mentre mTORC2 contiene il compagno rapamicina-insensibile di mTOR (Rictor)9. mTORC1 è in grado di integrare e trasmettere segnali importanti per regolare la crescita cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Recentemente, abbiamo dimostrato che mTORC1 svolge un ruolo chiave nella rete di riassorbimento dell’osso catabolico dall’eliminazione di Raptor per inattivare mTORC1 in osteoclasti10. Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nel presente studio, un metodo basato su RANKL osteoclastogenico è stato usato per generare gli osteoclasti da derivate da midollo osseo macrofagi (saggi) di wild-type (WT) e topi RapCtsk e di studiare l’influenza di inattivazione di mTORC1 su osteoclasto formazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.
Nello studio precedente, saggi erano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Minghan Tong e S. Kato per topi e gentilmente fornendo reagenti. Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da 973 programma dal Ministero cinese della scienza e tecnologia (MOST) [2014CB964704 e 2015CB964503], programma di ricerca clinica dell’ospedale di 9 persone, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Grazie per l’aiuto della funzione di memoria per biologia cellulare e funzione di memoria per biologia chimica, CAS Center for Excellence in molecolare di Cell Science, Shanghai Institute di biochimica e biologia cellulare, Accademia cinese delle scienze.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
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