Summary

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Published: November 15, 2017
doi:

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Abstract

Viele außergewöhnliche Fortschritte wurden in der Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics, mit bestimmten technischen Fortschritte in der Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und isobare Kennzeichnung multiplexing Kapazität. Hier stellen wir eine tief-Proteomics Profilerstellungs-Protokoll, die 10-Plex Tandem Masse Tag (TMT) Kennzeichnung mit einem umfangreichen LC/LC-MS/MS-Plattform und Korrektur der Post-MS numerische Störungen genau ganze Proteome quantitate kombiniert. Dieses Protokoll enthält die folgenden Hauptschritten: Proteingewinnung und Verdauung, TMT Kennzeichnung, 2-dimensionale (2D) LC, hochauflösende Massenspektrometrie und computergestützte Datenverarbeitung. Qualitätskontrolle-Schritte sind für die Fehlersuche und Auswertung experimenteller Variation enthalten. Mehr als 10.000 Proteine in Säugetieren Proben können getrost mit diesem Protokoll quantitated. Dieses Protokoll kann auch auf die Quantifizierung der post-translationalen Modifikationen mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Diese gebündelte, robuste Methode ist ein leistungsstarkes Tool für die Proteomik-Analyse in einer Vielzahl von komplexen Proben, einschließlich Zellkultur, tierischen Geweben und menschlichen klinischen Proben.

Introduction

Next Generation Sequencing technologische Fortschritte führten zu einer neuen Landschaft für die Untersuchung biologischer Systeme und Krankheit beim Menschen. Dies hat eine große Anzahl von Messungen des Genoms, Transkriptom, Proteom, Metabolom und andere molekulare Systeme greifbar werden erlaubt. Massenspektrometrie (MS) ist eine der empfindlichsten Methoden in der analytischen Chemie und ihre Anwendung in der Proteomik expandierte schnell nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms. In der Proteomik haben die letzten Jahren erhebliche technische Fortschritte in der MS-basierten quantitativen Analysen, einschließlich Isobaren Kennzeichnung und multiplexing Fähigkeiten kombiniert mit umfangreichen Flüssigchromatographie, neben Instrumentierung ergab. Vorschüsse, ermöglicht schnellere und genauere Messungen mit weniger Probenmaterial erforderlich. Quantitative Proteomik geworden ein mainstream-Ansatz für die Profilerstellung Zehntausende von Proteinen und posttranslationale Modifikationen im sehr komplexen biologischen Proben1,2,3,4 , 5 , 6.

Gemultiplexten isobare Kennzeichnung Methoden wie isobare Tag für relative und absolute Quantifizierung (d.h. iTRAQ) und Tandem-Massen-Tag (TMT) MS haben stark verbesserte Probendurchsatz und stieg die Zahl der Proben, die in einem einzigen analysiert werden können 1,6,7,8zu experimentieren. Zusammen mit anderen MS-basierte Quantifizierung Methoden wie markierungsfreie Quantifizierung und stabilen Isotop Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (d.h.SILAC), das Potenzial dieser Techniken in der Proteomik ist Feld beträchtliche9 ,10,11. Die TMT-Methode erlaubt zum Beispiel 10 Proteinproben zusammen mit 10-Plex-Reagenzien 1 Experiment analysiert werden. Diese baugleichen TMT-Tags haben die gleiche allgemeine Masse, aber schweren Isotope sind differentiell verteilt auf Kohlenstoff oder Stickstoff-Atome, wodurch eine einzigartige Reporter Ion während MS/MS Zersplitterung der einzelnen Tags, damit die relative Quantifizierung zwischen den 10 Proben. Die TMT-Strategie wird routinemäßig angewendet, um Studium biologischer Signalwege, Krankheitsverlauf und zelluläre Prozesse12,13,14.

Wesentliche technische Verbesserungen haben Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Systeme, sowohl in Bezug auf LC Trennungen und MS Parameter Proteinidentifikation zu maximieren, ohne Einbußen bei der Quantifizierung Genauigkeit verbessert. Erste Dimension Trennung von Peptiden durch eine Trennung Technik mit hoher Orthogonalität, die zweite Dimension ist entscheidend bei dieser Art der Schrotflinte Proteomics-Methode, um maximale Ergebnisse20zu erreichen. Hohem pH-Wert umgekehrt Phase flüssige Chromatographie (RPLC) bietet eine bessere Leistung als herkömmliche starke Kationenaustausch-Chromatographie20tut. Bei hohem pH-Wert RPLC-mit einer zweiten Dimension der Low-pH-RPLC-kombiniert wird, sind analytische Dynamikbereich und Protein Abdeckung verbessert wiederum die Möglichkeit, den Großteil der exprimierten Proteine zu identifizieren, wenn ganze Proteom Analysen15 durchführen, ,16,17,18. Andere technische Fortschritte sind kleine Partikel in C18 (1,9 µm) und lange Spalte (~ 1 m)19erweitert. Darüber hinaus sind andere bemerkenswerten Verbesserungen neue Versionen von Massenspektrometern mit schnellen Abtastraten, verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung20und anspruchsvolle Bioinformatik Pipelines für MS Data Mining21.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die neuesten Methoden mit Änderungen zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Durchsatz, während der Fokussierung auf Qualität Kontrollmechanismen in das Experiment beinhaltet. Das Protokoll enthält Proteingewinnung und Verdauung, TMT 10-Plex Kennzeichnung, grundlegende pH-Wert sauren pH-Wert RPLC-Fraktionierung, hochauflösende MS-Detektion und MS Datenverarbeitung (Abbildung 1). Darüber hinaus realisieren wir mehrere Qualitätskontrolle Schritte zur Fehlerbehebung und Auswertung experimenteller Variation. Dieses ausführliche Protokoll soll helfen Forschern neu auf dem Gebiet routinemäßig zu identifizieren und genau quantitate Tausende von Proteinen aus einem lysate oder Gewebe.

Protocol

Vorsicht: konsultieren Sie bitte vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (d.h., MSDS). Nutzen Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung dieses Protokolls. Hinweis: TMT 10-Plex isobare Reagenz Beschriftungssatz dient in diesem Protokoll für das Proteom-Quantifizierung von 10 Proben. 1. Vorbereitung der Zellen/Gewebe Hinweis: Es ist entscheidend für die Proben in kürzester Zeit zu sa…

Representative Results

Wir verwendet eine zuvor beschriebenen Cross-Arten Peptid-Mischung, um die Wirkung der Kompression Verhältnis in 3 großen Protokoll-Schritte, einschließlich pre-MS Fraktionierung, MS-Einstellungen und post-MS Korrektur23systematisch zu analysieren. Die pre-MS Fraktionierung wurde bewertet und optimiert mithilfe einer Kombination von grundlegenden pH RPLC und sauren pH-Wert RPLC. Für die post-MS Analyse galten nur artspezifische Peptide. Diese Störungen-Modell …

Discussion

Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex isobare Kennzeichnung Strategie, die erfolgreich in mehreren Publikationen12,13,14,32 umgesetzt worden . In diesem Protokoll können wir bis zu 10 verschiedene biologische Proteinproben in 1 Experiment analysieren. Wir können routinemäßig identifizieren und quantitate weit über 10.000 Prote…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken allen anderen Lab und Anlage Mitgliedern für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, und gewährt ALSAC. Die MS-Analyse wurde in der St. Jude Children Hospital Proteomics Forschungseinrichtung, teilweise unterstützt von NIH Cancer Center Support Grant P30CA021765 durchgeführt. Die Autoren danken Nisha Badders um Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

Materials

1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Play Video

Cite This Article
High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

View Video