Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma
Summary
Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS) birçok olağanüstü gelişmeler yaptık-sıvı Kromatografi (LC) belirli teknik ilerleme ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve izobarik etiketleme çoğullama kapasite birleştiğinde proteomik dayalı. Burada, bir geniş LC/LC-MS/MS platform ve doğru bir şekilde tüm proteomes quantitate için sonrası MS Hesaplamalı girişim düzeltme ile etiketleme 10-plex tandem toplu etiket (TMT) birleştiren bir derin-proteomik profil oluşturma protokolü tanıtmak. Bu iletişim kuralı aşağıdaki temel adımları içerir: protein ayıklama ve sindirim, TMT etiketleme, 2-boyutlu (2D) LC, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve sayısal veri işleme. Kalite kontrol adımları sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için dahil edilir. 10.000’den fazla proteinler memeli örnekleri arasında güvenle bu iletişim kuralı ile quantitated. Bu iletişim kuralı küçük değişiklikler ile sonrası translasyonel modifikasyonlar Nefelometri için uygulanabilir. Bu çoğaltılmış, sağlam yöntemi karmaşık örnekleri, hücre kültürü, hayvan doku ve insan klinik örnekler de dahil olmak üzere çeşitli proteomik analiz için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Yeni nesil sıralama teknolojisindeki ilerlemeler biyolojik sistemleri ve insan hastalık çalışmak için yeni bir manzara açmıştır. Bu ölçümler genom, transcriptome, Proteom, metabolome ve diğer moleküler sistemlerin somut olmak için çok sayıda izin vardır. Kütle spektrometresi (MS) analitik kimya en hassas yöntemlerinden biridir ve proteomik uygulaması hızlı bir şekilde insan genomu sıralama sonra genişledi. Proteomik alanında, son birkaç yıl içinde MS tabanlı kantitatif analizleri, izobarik etiketleme ve araçları yanı sıra kapsamlı sıvı Kromatografi ile birlikte yeteneği çoğullama da dahil olmak üzere önemli teknik gelişmeler vermiştir , daha hızlı, daha doğru ölçümler için daha az örnek malzeme gerekli izin ilerler. Nicel proteomik proteinler ve ardından değişiklikleri son derece karmaşık biyolojik örnekleri1,2,3,4 , on binlerce profil oluşturma için genel bir yaklaşım haline gelmiştir , 5 , 6.
Çoğaltılmış izobarik etiketleme gibi yöntemleri izobarik etiketi göreli ve mutlak Nefelometri (örneğin, iTRAQ) ve tandem kitle etiketi (TMT) MS için büyük ölçüde örnek işlem hacmi geliştirilmiş ve tek bir analiz örnekleri sayısı arttı 1,6,7,8deneme. Yanı sıra diğer MS tabanlı Nefelometri yöntemleri, etiket içermeyen Nefelometri ve kararlı izotop amino asitler (örneğin, SILAC), hücre kültüründe ile potansiyel proteomik teknikler etiketleme gibi önemli9 alandır ,10,11. Örneğin, TMT yöntemi 10 protein örneklerini birlikte 1 deneyde 10-plex reaktifler kullanarak çözümlenmesi için izin verir. Bu yapısal olarak özdeş TMT etiketleri aynı genel kitle var, ama ağır izotoplar differentially böylece göreli Nefelometri etkinleştirme her etiket, MS/MS parçalanma sırasında bir benzersiz muhabir iyon kaynaklanan karbon veya azot atomu dağıtılır 10 örnekleri arasında. TMT strateji rutin olarak biyolojik yollar, hastalık ilerleme ve hücresel12,13,14çalışmaya uygulanır.
Önemli teknik gelişmeler sıvı Kromatografi (LC)-MS/MS sistemleri, LC ayırmaları ve Nefelometri doğruluk ödün vermeden protein tanımlama en üst düzeye çıkarmak için MS parametreleri açısından hem de gelişmiş var. İlk boyut peptidler ikinci boyutu için yüksek dikeylilik ile ayırma tekniği ile20maksimum sonuçlar elde etmek için av tüfeği proteomik yöntemi bu tür kritik ayrılmasıdır. Yüksek pH ters fazlı sıvı Kromatografi (RPLL) geleneksel güçlü katyon değişim Kromatografi20daha iyi performans sağlar. Yüksek pH RPLL düşük pH RPLL ikinci bir boyut ile birleştirildiğinde, hem analitik dinamik alan ve protein kapsamı, Bütün-Proteom analizleri15 işlemi sırasında toplu ifade proteinlerin tanımlama yeteneği içinde kaynaklanan artırıldı ,16,17,18. Diğer teknik gelişmeler küçük C18 parçacıklar (1.9 µm) içerir ve genişletilmiş uzun sütun (~ 1 m)19. Ayrıca, diğer önemli iyileştirmeler hızlı tarama hızları, geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük20ve MS veri madenciliği21sofistike Biyoinformatik boru hatları ile Kütle Spektrometreleri yeni sürümlerini içerir.
Burada, duyarlılık ve işlem hacmi, kalite kontrol mekanizmaları deneme boyunca odaklanan geliştirmek için değişiklikler ile en son metodolojiler birleştirmek detaylı bir protokol açıklayın. Protokol protein ayıklama ve sindirim, 10-plex TMT etiketleme, temel pH ve asit pH RPLL ayırma, yüksek çözünürlüklü MS algılama ve MS veri işleme (şekil 1) içerir. Ayrıca, sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için çeşitli kalite kontrol adımları uygulayın. Bu ayrıntılı iletişim kuralı düzenli olarak tanımlamak ve doğru bir şekilde proteinler üzerinden bir lysate binlerce quantitate araştırmacılar yeni alana yardımcı olma amacını taşıyan veya doku.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz yüksek üretilen iş iletişim kuralı olan çeşitli yayınları12,13,14‘ te,32 başarıyla uygulanan bir 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin Nefelometri için tarif . Bu protokol için ilâ 10 farklı biyolojik protein örnekleri 1 denemede analiz edebiliriz. Düzenli olarak tanımlamak ve 10.000 Eh proteinler yüksek güven ile quantitate. İzobarik etiketleme protei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar tüm diğer laboratuar ve tesis üyeler yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ve ALSAÇ verir. MS analizi St. Jude çocuk Araştırma Hastanesi proteomik tesiste, kısmen desteklenen NIH Kanser Merkezi destek grant P30CA021765 tarafından seslendirildi. Yazarlar Nisha Badders el yazması düzenleme konusunda yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
