Summary
Этот протокол демонстрирует индукции мозгового кавернозных мальформация болезни в мышиной модели и контраст использует расширение Микро Компьютерная томография для измерения поражения бремя. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения молекулярные основы и потенциальных терапий для церебральной кавернозных мальформация и другие цереброваскулярные заболевания.
Abstract
Мутации в CCM1 (ака KRIT1), CCM2, или CCM3 (ака PDCD10) гена вызывает церебральный кавернозных мальформация (СКК) в организме человека. Модели мыши CCM болезни были созданы тамоксифен индуцированной удаления Ccm генов в послеродовой животных. Эти модели мыши обеспечивают неоценимое расследовать молекулярный механизм и терапевтические подходы для СКК болезни. Точная и количественный метод оценки поражения бремя и прогрессии необходимо использовать полную стоимость этих животных моделей. Здесь мы демонстрируем индукции CCM болезни в мышиной модели и расширить использование контраст рентгеновского Микро Компьютерная томография (микро CT) метод измерения CCM поражения бремени в мозг мыши. На послеродовом день 1 (P1) мы использовали 4-hydroxytamoxifen (4HT) для активации Cre рекомбиназа деятельности от Cdh5-CreErt2 трансген к расщеплять аллеля floxed Ccm2. CCM поражений в мозг мыши были проанализированы на P8. Для микро CT раствор Люголя на основе йода была использована для повышения контраста в ткани мозга. Мы имеем оптимизированы параметры сканирования и использовали voxel измерение 9,5 мкм, которая приведет к минимальным размером около 25 мкм. Эта резолюция является достаточно измерить объем поражения СКК и номер глобально и точно, и обеспечить высокое качество 3-D картирование CCM поражений мозга мыши. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения потенциальных терапий и молекулярные основы для СКК и другие цереброваскулярные заболевания.
Introduction
CCM тонкими стенками, расширены сосудистые мальформации в мозге с преобладанием до 0,5% в человеческой популяции1. СКК может наследоваться как доминирующей расстройство из-за потери функции мутации в одном из трех генов: CCM1 (ака Krit1), CCM2и CCM3 (также называемый PDCD10)2,3,4 ,5,6. Эти гены присутствуют в одном сигнализации комплекс.
Были разработаны различные модели модель болезней человека СКК и понять течению тропы CCM гены, которые отвечают за CCM7,8,9,10. Самые надежные модели является условно удалять любой из генов СКК с тамоксифен индуцибельной Cdh5-CreERT2 в точке P1 в новорожденных детенышей8,10. Эти щенки развиться поражения СКК в мозг от P6 вперед и, как ожидается, будет идеальная модель для доклинических исследований в поиске механизмов и терапевтических агентов в лечении заболеваний СКК.
CCM поражения бремя в мозг мыши измеряется прежде всего методы, основанные на гистологию, подход, который чрезвычайно много времени и при условии следователь смещения10,,1112. МРТ основе методы были использованы для оценки СКК поражения бремя взрослых мыши модель9,13. Однако высоко специализированных малых животных МРТ инструмента и долгое время проверки нескольких часов в ночь требуется для достижения удовлетворительного решения для выявления поражений СКК. Кроме того не было сообщено ли МРТ может использоваться для обнаружения CCM поражений у новорожденных мышей и резолюции может ограничить чувствительность.
Мы недавно разработали технику микро CT изображения и анализировать CCM поражения14,15. Это с высоким разрешением, время и экономически эффективным методом резко повысило значение модели болезни СКК в механистический и терапевтических исследований. Повышение контрастности, вся гора пятная методы были использованы для микро-КТ мягких тканей и мыши эмбрионов16,17. Ранее мы использовали на основе осмий окрашивания для повышения контраста для микро-КТ CCM поражения мозга14. В этой статье мы использовали менее токсичны, неразрушающего, и экономически эффективных реагентов, йода на основе раствор Люголя в, чтобы увеличить контраст для микро-КТ. Йод может распространять по всему мозгу и имеет высокое сродство для крови18.
Здесь представлены подробный протокол индукции CCM поражений в неонатальной мыши модели наряду с изображений и анализа CCM поражений с контраст основе микро CT. Этот метод на основе микро КТ обеспечивает количественных глобальное измерение объема поражения СКК, точно определяет количество и расположение 3-D CCM поражений головного мозга мыши и значительно снижает стоимость и время, необходимое для фенотип этих животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
всех животных этики и протоколы были одобрены Сидней местного здравоохранения животных благосостояния райисполкома и институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Тяньцзинь медицинского университета. Все эксперименты проводились в соответствии с положениями руководящих принципов, столетний юбилей института, Университет Сиднея и Tianjin медицинский университет
1. Индукции мозгового кавернозные мальформации в моделях мыши
- крест Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl мышей с Ccm2 fl/fl для создания помета с Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) детенышей и помёте контроля (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 и Ccm2 fl/fl животных были ранее описанных 19.
- Распустить 4HT в 100% этанола и хранить при температуре-80 ° C в аликвоты 30 мкл (концентрация 4HT: 10 мг/мл). В день использования, разбавить aliquoted 4HT в кукурузном масле (0.5 мг/мл).
- Intragastrically инъекционные 50 мкл 4HT (0.5 мг/мл) для новорожденных щенков на P1 чтобы побудить экспериментальных поражениях CCM, с помощью шприца инсулина.
2. Пробоподготовка для микро-КТ
- усыпить новорожденных щенков через удушение двуокиси углерода на P8.
- Выполнять внутри сердца перфузии, вставив 29 иглы с 3 мл 2% параформальдегида в PBS в шприц 10 мл в желудочке сердца мыши.
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите соответствующую защиту. - Отсоедините головы от тела с помощью ножниц. Удалите все кожу с головы, с помощью ножниц и шелушиться черепа с помощью щипцов для рассечения весь мозг.
- Принимать изображения мозга с стереомикроскопом на 7,82 x увеличение, 1 x прибыль, 0.6 гамма и время воздействия 20 мс.
- Исправить расчлененных мозги с параформальдегида 4% в растворе PBS на ночь.
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите соответствующую защиту. - На следующий день, отсоединить hindbrains, с помощью щипцов и промыть раствором PBS.
- Hindbrains в Люголя инкубировать ' s раствор йода для 48 ч.
- Кратко после инкубации, воздух сухой hindbrains для удаления избыточных Люголя ' раствор йода ф.
- Пакет Люголя ' s йода окрашенных hindbrains 0,65 мл microcentrifuge труб и уплотнения полностью с пластиковых парафин фильм, чтобы избежать усадки ткани ( рис A).
- Место microcentrifuge трубы в 5 мл пластиковых трубок с губки для предотвращения их перемещения во время сканирования ( рис. 2 B).
3. Микро-КТ сканирования СКК в мозг мыши
- вертикально Установите задний мозг, Упакованные в трубку на алюминиевый держатель в системе микро CT.
- Задать параметры проверки 540 прогнозы и 2 s Выдержка с исходных условий 50 кв и 10 Вт приобрести томографических наборов данных (изображения резолюции 9.5 мкм/пиксел).
- Рентгенограммах от сканирования восстанавливаются автоматически аппаратные проекции восстановления программного обеспечения, предоставляемые системой микро CT, производит изображения серии из 16-разрядных осевых срезах (" TXM " файл).
4. Анализ наборов данных микро-CT
- Открыть файл восстановленные изображения (" TXM " файла) в 3-D анализ программного обеспечения и визуализировать с помощью мозга " объемный рендеринг " функция.
- Преобразование задний мозг в желаемой ориентации с помощью " ограничивающего " и " плоскости отсечения " функций.
- Resample преобразованные изображения в расширенном режиме и сохранить размер вокселей.
- Создание " редактировать новое поле Метка " на преобразованном изображении (4.3) и выделить только задний мозг, используя оттенки серого интенсивности.
- Добавления выделенных областей и запустить " ярлык анализ " чтобы получить измерения весь задний мозг (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в Excel файле.
- Визуализировать с помощью задний мозг " изоповерхности рендеринга " функция.
- Создать другую " поле новый ярлык " на преобразованные изображения и выделить районы с поражениями, используя оттенки серого интенсивности.
- Добавления выделенных областей и запустить " лейбл " анализ для получения измерения поражения внутри задний мозг (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в Excel файле.
- Визуализировать поражения с помощью " создавать поверхности " и " поверхности вид " функций.
- Снимок изображения задний мозг на желаемой ориентации или создать фильм для 3-D визуализации поражений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной инъекции 4HT в P1 было достаточно, чтобы побудить CCM поражения мозжечка. Люголя в йода контрастировали микро CT достаточно обнаружено CCM поражения и может определить ее объем и число. Использование оптимизированного микро CT, мы imaged CCM поражений в hindbrains Ccm2iECKO мышей. Сканированные рентгеновских изображений были реконструированы для создания трехмерных изображений мозга мыши, что позволило визуализации всего поражений в паренхиме мозга на разных глубинах и ориентации и оценку структуры и 3-D расположение поражений головного мозга. Важно отметить, что этот образ dataset также может использоваться для эффективного и точного количественного определения размеров поражения и поражения чисел.
Рисунок 1 показывает успешный индукции CCM поражения мозжечка Ccm2iECKO (B), но не в помёте контроля (Ccm2fl/fl) (A) на P8.
На рисунке 2 показан образец Упакованные для микро-КТ (BA–), и представитель реконструкции изображения от микро-КТ управления (Ccm2fl/fl) (C) и Ccm2 iECKO (ED–). Рисунок 2 E' показывает отмечены поражений в Ccm2iECKO.
Рисунок 3 показывает трехмерного рендеринга Ccm2iECKO мозга с поражениями (BA–). Прилегающих таблице показан пример количественного производства помечены индивидуального поражения.
Рисунок 1 : Индукция CCM поражений у новорожденных мышей. Макроскопические образы Ccm2fl/fl (A) и (B) Ccm2iECKO мозги на 8 день послеродового. Масштаб баров (белый), 5 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Пробоподготовки и реконструирован 2D изображения. Образец упакован в пробки microcentrifuge (A) и 5 мл трубки (B). Зеленая стрелка показывает пример. Представитель образы Ccm2fl/fl (C) и мозги Ccm2iECKO (ED–). (E') Отмеченные поражений в Ccm2iECKO мозга. Масштаб баров (белый), 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Визуализации трехмерных изображений. Рендеринг изображения Ccm2iECKO мозга с поражения (A) и поражения только (B). Поражения отмечены красным цветом. В таблице справа показывает пример качественного вывода отдельно помеченные поражений. Масштаб баров (белый), 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
СКК является общей сосудистая мальформация, которое затрагивает до 0,5% лиц1. СКК может происходить в форме спорадические или семейная. Пациента прогноз часто неясно, как СКК поражений может неожиданно разрыву вызвать инсульт и другие неврологические последствия. В настоящее время единственным вариантом является хирургическое удаление поражений, которые сопровождаются высоким риском.
CCM условия недавно были воспроизведены в животных моделей,78,9,10. Эти модели обеспечивают неоценимое значение для изучения механизмов, участвующих в СКК болезни. Точный, эффективный и количественного анализа метод поможет освоить полную стоимость этих моделей.
Мы недавно разработали метод микро CT изображения CCM поражений в моделях мыши, с помощью tetraoxide осмий как контрастные агент14. В текущем исследовании мы впоследствии использовали в Люголя раствор йода для повышения контраста ткани мозга для выявления поражений. Йода раствор Люголя в менее токсичные, неразрушающего и дешевле по сравнению с tetraoxide осмий. Следовательно образцы могут быть использованы для других целей, например гистологии после смыл раствор Люголя в йода.
Наш метод микро CT может производить достаточно качество изображения для обнаружения CCM поражений головного мозга мыши. Подготовка образца прост и не требует узкоспециализированных методов. Этот метод может обеспечить высоким разрешением прогнозы с время сканирования примерно один час. Объединение наборов данных из микро-КТ и 3-D программное обеспечение является мощным средством для создания 3-D глобальное представление CCM поражений в мозге. Количественные и качественные представление поражения по отношению к анатомии мозга легко достигнута. По сравнению с гистология основе трехмерной реконструкции, наш метод весьма время - и экономичным и производит гораздо более точные объемного представления.
Однако есть также ограничения и критические шаги для рассмотрения. Во-первых этот метод требует микро CT системы, которая является весьма специализированным оборудованием и не могут быть легко доступны. Во-вторых рассекает мозга новорожденных мыши может быть довольно сложной задачей из-за мягкости и размер ткани мозга. Это очень важно, чтобы не повредить мозг во время вскрытия для того чтобы получить точные измерения и визуализации СКК поражений головного мозга. И наконец Пробоподготовка для микро-КТ имеет решающее значение. Раствор Люголя окрашенных мозги должны быть упакованы полностью, чтобы избежать усадки ткани за счет испарения. Кроме того образцы должны быть надежно помещены в микро-КТ. Любое движение во время сканирования изменит качество сканирования и поэтому количественная оценка и визуализации.
Мы применили метод только в фиксированных новорожденных мыши мозги. Однако этот метод имеет способность быть использованы для других исследований с участием различных образцов и может служить инструментом захватывающее и Роман для других сосудистая мальформация исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают, зал и научной и технической помощи Sydney микроскопия и микроанализ исследовательский фонд (AMMRF) и Австралийский центр по микроскопия и микроанализ АКММ в Университете Сиднея. Эти исследования были поддержаны австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проект Грант 161558 и APP1124011 (XZ).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).