הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את טכניקות שונות הדרושות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים כולל צביעת שלילי, חלוקתה ודק במיוחד עבור מבנה נתונים היסטוריים, חיסונית-זהב labelling כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים ב- exosomes.
Abstract
Exosomes בגודל ננו שלפוחית חוץ-תאית מופרש על ידי נוזלי הגוף, ידועים כדי לייצג את המאפיינים של תאים מפרישים אותם. התכנים ואת המורפולוגיה של השלפוחיות המוגלתיות המופרש לשקף בהתנהגות התא או מצב פיזיולוגי, לדוגמה צמיחת תאים, הגירה, המחשוף ומוות. התפקיד של exosomes תלויה מאוד בגודל, הגודל של exosomes משתנה בין 30 ל- 300 ננומטר. השיטה הנפוצה ביותר עבור הדמיה exosome הוא מכתים שלילי, ואילו תוצאות אחרות מבוססות על מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה-הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי. המורפולוגיה של exosome טיפוסי העריך דרך מכתים שלילי גביע-צורה, אבל עוד יותר פרטים עדיין אינן ברורות. מאופיין היטב באמצעות לימוד המבנית exosome הוא הכרחי במיוחד בתחומים הרפואי ובתחום הרוקחות. לכן, מורפולוגיה תלוית פונקציה צריך להיות מאומת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים טכניקות כגון תיוג חלבון מסוים במבנה נתונים היסטוריים של exosome. להתבונן מבנה נתונים היסטוריים, הושוו תמונות משרטוטי זגוגית ותמונות מוכתם השלילי של exosomes. ב פרוטוקול זה, אנו מציעים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים עבור ההדמיה של exosomes כולל צביעת שלילי, מכתים חיסונית הר שלמה, הכנה בלוק, מקטע דק, וסימון חיסונית-זהב.
Introduction
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם השומנים bilayer שלפוחית מופרש על ידי תאי, גודלם נע בין 30 עד 300 ננומטר. EVs דווחו לראשונה בשנת 1978 עם עדויות שלפוחית של חולים עם מחלת הודג’קין1. שלפוחית אלה דווחו להיות 40 עד 120 ננומטר בגודלם. בשנת 1980, נמסר EVs מעורבים פקקת, היווצרות קריש דם בתוך כלי דם סרטן המטופלים2ומערכת קרישת הדם. אחרי 30 שנה, EVs דווחו להיות גורם חשוב לקדם את הגידול הפלישה, הבריחה מחוסן ואנגיוגנזה3. בנוסף, הפונקציות של EVs נחקרו כמבקרי באינטראקציה תאית בתחומים של דלקת, הפרעות המערכת החיסונית, מחלות נוירולוגיות סרטן4. EVs מכילות מולקולות ספציפיות כגון חלבון, mRNA microRNA5, שלהם פוטנציאל היישום אבחון ו הרפוי מאז שנותחה6,7. EVs הם קטגוריה מורכבת של קבוצות כולל exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ו exosome דמויי שלפוחית, בהתאם מקור הסלולר שלהם פונקציה ביולוגית3. בנוסף, על סמך להן שלהם, EVs אלה ניתן לחלק שלפוחיות זעירות (שלפוחיות זעירות לסככה, nm 100-1000) ו- exosomes (30-300 ננומטר)8,9. בין אלה, exosome דווחה מתקשרת תא התגובה החיסונית10,11,סרטן12של מחלה זיהומית13.
עניין exosomes כמו סמן לאבחון מוקדם גדלה במהירות, לטיהור ודה -אפיון של exosomes חייב להיות מלווה עם טכניקות הדמיה מולקולרית. גדלים מורפולוגיות של exosomes, בהתאם שלהם מוצא ותפקוד14, ניתן להבחין על ידי טכניקות במיקרוסקופ עם רזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. רוב exosomes היו דמיינו ידי שלילי מוכתם הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)15,16,17, תוצאות אלה שאושרו על-ידי immunolabeling של חלבון ספציפי ב הר כל שלפוחית 18. מספר קבוצות המחקר דיווחו על המבנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי19,20, הקפאה-TEM21,22. עם זאת, ואילו טכניקות אלה שימושיים עבור לימוד מבנה exosome, הם אינם מספיקים להתבוננות המיקום של חלבונים ספציפיים הממוקם בתוך exosome. לכן, הצגנו פרוטוקול הדמיה exosomes עם תוויות של חלבון ספציפי. אנחנו מוחלים בלוק הכנה, חלוקתה ודק במיוחד ו immunostaining עבור ברור מיקום מפורט של החלבון exosome. זה היה לעומת מכתים שלילי ואת כל הר immunostaining, המשמש באופן מסורתי אפיון exosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול להתבוננות המבנה של exosome מפורט תיוג מהחלבונים ספציפיים. צביעת שליליות נחשב כמו השיטה הטובה ביותר עבור exosome הדמיה17. הטכניקה המקובלת הזו מראה מבנה דמוי ספל של exosomes. עם זאת, צורת גביע היא צורה של החפץ יכול להתרחש עקב תהליך הייבוש. הקפאה-TEM התוצאות הראו כי exosomes י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הצלת חיים & תוכנית פיתוח טכנולוגיה רפואית של קרן המחקר הלאומי (NRF) & ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP & MOHW) (מספר 2016M3A9B6904244). אנו מודים גם חברי המרכז לחקר Medicinal Bioconvergence טיהור של exosome.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
