Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии
Summary
Этот протокол описывает различные методы, необходимые для передачи электронной микроскопии включая негативные окрашивание, ультратонкий секционирование для подробной структуры и иммуно gold маркировки для определения позиции специфических белков в exosomes.
Abstract
Exosomes нано размера внеклеточного везикулы, выделяемый жидкости организма и известны представляют характеристики клеток, которые выделяют их. Содержание и морфология секретируемые везикулы отражают поведение клеток или физиологического статуса, например рост клеток, миграция, расщепление и смерти. Exosomes роль может сильно зависеть от размера, и размер exosomes варьируется от 30 до 300 Нм. Наиболее широко используемый метод для exosome изображений является отрицательным окрашивания, в то время как другие результаты основаны на крио-просвечивающей электронной микроскопии, сканирование электронной микроскопии и атомной силовой микроскопии. Типичный exosome морфология через негативные окрашивание является Кубок форму, но дальнейшие детали еще не ясно. Exosome, хорошо изученных через структурные исследования является особенно необходимым в медицинской и фармацевтической областях. Таким образом функция зависимых морфология должны быть проверены на методы электронной микроскопии, такие как маркировки определенных белков в детальной структуре exosome. Наблюдать за подробную структуру, были сопоставлены ультратонких секционного изображения и негативное витражные изображения exosomes. В этом протоколе мы предлагаем просвечивающей электронной микроскопии для изображений exosomes, включая негативные окрашивание, вся гора иммуно-окрашивание, блок подготовки, шлифов и иммуно золото маркировки.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs) являются липидного бислоя везикулы выделяется клетками, и их размер колеблется от 30 до 300 Нм. EVs впервые сообщалось в 1978 году, с доказательствами из везикул больных болезнь Ходжкина1. Эти пузырьки были сообщается 40 до 120 нанометров размер. В 1980 году было сообщено, что EVs участвуют в свертывающей системы и тромбоз, формирование сгусток крови внутри сосудов в раковых больных2. После 30 лет чтобы быть важным фактором содействия прорастание опухоли, иммунных бежать и ангиогенез3поступили EVs. Кроме того функции EVs были изучены как регуляторов в клеточных взаимодействия в области воспаления, иммунных расстройств, неврологических заболеваний и рака4. EVs содержат конкретные биомолекул как белок, мРНК и микроРНК5, их потенциальное применение в диагностике и терапии пор анализируемого6,7. EVs – это категория, состоящий из подгрупп, включая exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, микрочастицы, promininosomes, argosomes и exosome как пузырьки, в зависимости от их клеточных происхождения и биологическая функция3. Кроме того основываясь на их биогенеза, эти EVs можно разделить микровезикулы (сарай микровезикулы, 100-1000 Нм) и exosomes (30-300 Нм)8,9. Среди них exosome было сообщено как мобильный коммуникатор иммунный ответ10, рака11,12и13инфекционных заболеваний.
Быстро растет интерес к exosomes в качестве биомаркеров для ранней диагностики и очистки и характеристика exosomes должен сопровождаться молекулярные методы визуализации. Различных размеров и морфологии exosomes, в зависимости от их происхождения и функции14, можно отличить по методам микроскопии с высоким разрешением, таких как электронной микроскопии. Большинство exosomes были визуализированное негативное витражные передачи электронной микроскопии (ТЕА)15,16,17, и эти результаты были подтверждены immunolabeling определенного белка в целом гора везикул 18. несколько исследовательских групп сообщили структуры через сканирование электронной микроскопии, атомной силовой микроскопии19,20и крио-ТЕА21,22. Однако хотя эти методы полезны для изучения структуры exosome, они являются недостаточными для наблюдения за позицию специфических белков, расположенный внутри exosome. Таким образом мы ввели протокол для изображений exosomes с протеином конкретных маркировки. Мы применили блок подготовки, ультратонкий секционирование и иммуноокрашивания для выяснения подробных расположение белка в exosome. Это было по сравнению с отрицательным окрашивание и вся гора иммуноокрашивания, который традиционно используется для описания exosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья представляет протокол для наблюдения за подробный exosome структуры и маркировки своих специфических белков. Отрицательный пятнать рассматривается как лучший метод для exosome изображений17. Эта традиционная методика показал exosomes Кубок образной структуры. Однако эта…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано био & медицинской технологии развития программы Национальный исследовательский фонд (NRF) & финансируется корейским правительством (MSIP & MOHW) (№ 2016M3A9B6904244). Мы также благодарим членов лекарственные Bioconvergence научно-исследовательского центра для очистки exosome.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
