ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल विस्तृत संरचना के लिए ऋणात्मक धुंधलान, ultrathin सेक्शनिंग सहित ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक विभिन्न तकनीकों का वर्णन करता है, और exosomes में विशिष्ट प्रोटीन की स्थिति निर्धारित करने के लिए bliss-गोल्ड ्र ।
Abstract
Exosomes नैनो-आकार extracellular बुलबुले शरीर के तरल पदार्थ से स्रावित होते हैं और उन्हें गुप्त कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए जाना जाता है । सामग्री और स्रावित बुलबुले के आकृति विज्ञान सेल व्यवहार या शारीरिक स्थिति को प्रतिबिंबित, उदाहरण के लिए सेल विकास, प्रवास, दरार, और मौत. exosomes ‘ भूमिका अत्यधिक आकार पर निर्भर हो सकता है, और exosomes का आकार 30 से ३०० एनएम के लिए बदलता है । exosome इमेजिंग के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि नकारात्मक धुंधला है, जबकि अंय परिणाम क्रायो-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी पर आधारित हैं । ठेठ exosome की आकृति विज्ञान नकारात्मक धुंधला के माध्यम से मूल्यांकन एक कप आकार है, लेकिन आगे विवरण अभी तक स्पष्ट नहीं कर रहे हैं । एक अच्छी तरह से संरचनात्मक अध्ययन के माध्यम से विशेषता exosome चिकित्सा और दवा क्षेत्रों में विशेष रूप से आवश्यक है । इसलिए, फ़ंक्शन-निर्भर आकृति विज्ञान exosome की विस्तृत संरचना में एक विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए । विस्तृत संरचना का निरीक्षण करने के लिए, ultrathin खोदी छवियों और exosomes के नकारात्मक दाग छवियों की तुलना में थे । इस प्रोटोकॉल में, हम नकारात्मक धुंधला, पूरे माउंट bliss-धुंधला, ब्लॉक तैयारी, पतले सेक्शन, और bliss-गोल्ड लेबलिंग सहित exosomes के इमेजिंग के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का सुझाव देते हैं ।
Introduction
Extracellular बुलबुले (ईवीएस) लिपिड bilayer बुलबुले कोशिकाओं द्वारा स्रावित कर रहे हैं, और उनके आकार 30 और ३०० एनएम के बीच पर्वतमाला । ईवीएस पहले १९७८ में रिपोर्ट किया गया है Hodgkin रोग1के साथ रोगियों के बुलबुले से सबूत के साथ । इन बुलबुले के आकार में ४० से १२० nanometers होने की सूचना थी । १९८० में, यह बताया गया कि ईवीएस जमावट प्रणाली और घनास्त्रता, कैंसर रोगियों में एक रक्त वाहिनियों के अंदर एक खून का थक्का के गठन में शामिल कर रहे हैं2. 30 साल के बाद, ईवीएस को ट्यूमर के आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक होने की सूचना दी गई है, प्रतिरक्षा भागने, और angiogenesis3। इसके अलावा, ईवीएस के कार्य सूजन के क्षेत्रों में सेलुलर बातचीत में नियामकों के रूप में अध्ययन किया गया है, प्रतिरक्षा विकार, स्नायविक रोग, और कैंसर4. चूंकि ईवीएस प्रोटीन, mRNA, और microRNA5के रूप में विशिष्ट अणुओं होते हैं, निदान और चिकित्सकीय में अपने संभावित आवेदन6,7विश्लेषण किया गया है । ईवीएस exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes, और exosome-बुलबुले की तरह, अपने सेलुलर मूल और जैविक समारोह3के आधार पर सहित उपसमूहों से बना एक वर्ग हैं । इसके अलावा, उनकी उत्पत्ति के आधार पर, इन ईवीएस microvesicles (शेड microvesicles, १००-१००० एनएम) और exosomes (30-300 एनएम)8, 9 में विभाजित किया जा सकता है । इनमें से, exosome प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया10, कैंसर11,12, और संक्रामक रोग13के लिए एक सेल कम्युनिकेटर के रूप में सूचित किया गया है ।
प्रारंभिक निदान के लिए एक exosomes के रूप में ब्याज तेजी से बढ़ती जा रही है, और exosomes के शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन आणविक इमेजिंग तकनीक के साथ किया जाना चाहिए । अलग आकार और exosomes के morphologies, उनके मूल और समारोह के आधार पर14, ऐसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में उच्च संकल्प, के साथ सूक्ष्म तकनीक द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । अधिकांश exosomes नकारात्मक सना हुआ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)15,16,17, और इन परिणामों की पुष्टि की गई पूरे माउंट में एक विशिष्ट प्रोटीन के immunolabeling द्वारा किए गए थे पुटिका 18. कई अनुसंधान समूहों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी19,20, और क्रायो-उनि21,22के माध्यम से संरचना की सूचना दी है । हालांकि, जबकि इन तकनीकों exosome संरचना का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, वे exosome अंदर स्थित विशिष्ट प्रोटीन की स्थिति देख के लिए अपर्याप्त हैं । इसलिए, हम एक विशिष्ट है प्रोटीन लेबलिंग के साथ इमेजिंग exosomes के लिए एक प्रोटोकॉल की शुरुआत की । हम exosome में प्रोटीन के विस्तृत स्थान का पता लगाने के लिए ब्लॉक तैयारी, ultrathin अनुभाग, और immunostaining लागू । इस नकारात्मक धुंधला और पूरे माउंट immunostaining, जो परंपरागत रूप से exosome के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ तुलना की गई ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख विस्तृत exosome की संरचना और उसके विशिष्ट प्रोटीन के लेबल देख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । नकारात्मक धुंधला exosome इमेजिंग17के लिए सबसे अच्छी विधि के रूप में माना गया है । इस पारंपरिक त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध का समर्थन बायो & #38; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम & #38; कोरियन सरकार (MSIP & #38; MOHW) (No. 2016M3A9B6904244) द्वारा वित्तपोषित । हम भी exosome के शुद्धिकरण के लिए औषधीय अभिसरण अनुसंधान केंद्र के सदस्यों को धंयवाद ।
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
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