यौन संचारित संक्रमणों की रोकथाम के लिए Griffithsin-संशोधित फाइबर पाड़ों का निर्माण और लक्षण वर्णन
Summary
इस पांडुलिपि के निर्माण और Griffithsin संशोधित पाली (लैक्टिक-co-glycolic एसिड) electrospun फाइबर है कि मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 संक्रमण के खिलाफ शक्तिशाली चिपकने वाला और एंटीवायरल गतिविधि का प्रदर्शन विशेषता की प्रक्रिया का वर्णन इन विट्रो में। संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, सतह को संशोधित, और जिसके परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान, विकार, और सतह संशोधित तंतुओं से Griffithsin के desorption की विशेषता वर्णित हैं ।
Abstract
Electrospun फाइबर (EFs) व्यापक रूप से चिकित्सीय अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, वे हाल ही में एक तकनीक को रोकने और यौन संचारित संक्रमण (एसटीआई) के इलाज के रूप में लागू किया गया है । इसके अलावा, कई EF प्रौद्योगिकियों को सक्रिय एजेंट encapsulating पर ध्यान केंद्रित, सतह का उपयोग करने के लिए सापेक्ष कार्यक्षमता प्रदान करने के लिए रिश्तेदार । यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए निर्माण और सतह-संशोधित पाली (लैक्टिक-co-glycolic) एसिड (PLGA) electrospun फाइबर, प्रबल एंटीवायरल लेक्टिन Griffithsin (GRFT) के साथ । PLGA एक एफडीए अनुमोदित बहुलक है कि व्यापक रूप से अपने बकाया रासायनिक और जैव संगत गुणों के कारण दवा वितरण में इस्तेमाल किया गया है । GRFT एक प्राकृतिक, शक्तिशाली, और सुरक्षित लेक्टिन है कि मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) सहित कई वायरस के खिलाफ व्यापक गतिविधि के पास है । जब संयुक्त, GRFT-संशोधित फाइबर एचआईवी के प्रबल निष्क्रियता का प्रदर्शन किया है-1 इन विट्रो। इस पांडुलिपि के तरीकों का वर्णन करने के लिए बनाना और GRFT-संशोधित EFs विशेषताएं । सबसे पहले, PLGA फाइबर पाड़ बनाने के लिए electrospun है । फाइबर बाद में सतह-1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) और N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) रसायन विज्ञान का उपयोग कर GRFT के साथ संशोधित कर रहे हैं । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के आकार और सतह संशोधित योगों के आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । साथ ही, gp120 या hemagglutinin (HA) आधारित एलिसा को GRFT संयुग्मित की मात्रा के साथ-साथ फाइबर की सतह से GRFT desorption के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल और अधिक व्यापक रूप से फाइबर कि सतह-अलग प्रोटीन की एक किस्म के साथ संशोधित कर रहे है बनाना लागू किया जा सकता है ।
Introduction
एक सामयिक प्रसव मंच के रूप में EFs के उपयोग के लिए काफी एसटीआई कम करने की क्षमता है । वर्तमान में, वहां ३६,०००,००० से अधिक एचआईवी के साथ रहने वाले लोग हैं, २,०००,००० से अधिक नए मामलों के साथ २०१५ अकेले1,2में रिपोर्ट की । इसके अतिरिक्त, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 2 (एचएसवी-2) संक्रमण दुनिया भर में लाखों लोगों के सैकड़ों को प्रभावित करता है और 2-5गुना3 द्वारा एचआईवी के अधिग्रहण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । एचएसवी-2 संक्रमण और एचआईवी अधिग्रहण के बीच इस संबंध के कारण, वहां कई एसटीआई के खिलाफ एक साथ सुरक्षा प्रदान कि नए सक्रिय एजेंटों के विकास में महत्वपूर्ण रुचि है । इसके अलावा, इन एंटीवायरल एजेंटों के वितरण में सुधार करने के लिए नए वाहनों के विकास के लिए और अधिक सुरक्षा और चिकित्सीय शक्ति को बढ़ाने की क्षमता प्रदान करता है । इस लक्ष्य की ओर, EFs एक नया वितरण मंच के रूप में जांच की गई है एचआईवी के प्रसार-1 और एचएसवी-2 संक्रमण को कम ।
पिछले दो दशकों के दौरान, EFs बड़े पैमाने पर दवा वितरण और ऊतक इंजीनियरिंग के खेतों में इस्तेमाल किया गया है4। अक्सर, आसानी से चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अनुवाद करने के लिए संगत पॉलिमर का चयन कर रहे हैं । बहुलकत्मक EFs बनाना, चयनित बहुलक एक कार्बनिक विलायक या जलीय समाधान में भंग है, बहुलक hydrophobicity की डिग्री के आधार पर5। ब्याज की सक्रिय एजेंटों तो electrospinning प्रक्रिया से पहले विलायक या जलीय समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है । बहुलक समाधान तो एक सिरिंज में aspirated है और धीरे से बाहर निकाले जबकि एक विद्युत प्रवाह के अधीन । इस प्रक्रिया को आम तौर पर शीट या बेलनाकार macrostructures (चित्रा 1), और फाइबर व्यास माइक्रो-नैनो पैमाने6से लेकर के साथ बहुलक फाइबर में परिणाम है । सबसे चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए, सक्रिय एजेंटों electrospinning प्रक्रिया के दौरान फाइबर के भीतर शामिल कर रहे हैं और प्रसार और बाद में फाइबर क्षरण के माध्यम से फाइबर से जारी कर रहे हैं. गिरावट या रिहाई की दर पॉलिमर या बहुलक मिश्रणों के विभिंन प्रकार का उपयोग करने के लिए एक वांछित जारी प्रोफ़ाइल स्थापित करने, अद्वितीय रासायनिक और शारीरिक गुण बीटेक के द्वारा बदला जा सकता है7, और वस्तुतः किसी के encapsulation को बढ़ावा देने कंपाउंड. जैसे, EFs छोटे अणु दवाओं और प्रोटीन, पेप्टाइड्स, oligonucleotides, और विकास कारकों6,8,9सहित जैविक एजेंटों के वितरण के लिए फायदेमंद साबित कर दिया है ।
STI निवारण के क्षेत्र में, EFs हाल ही में शामिल है और एंटीवायरल एजेंटों की निरंतर-या inducible-रिलीज प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. एक से अधिक अध्ययन में, पीएच-उत्तरदायी तंतुओं महिला प्रजनन पथ (FRT) के भीतर पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में सक्रिय एजेंटों को रिहा करने के लिए विकसित किया गया था, एचआईवी के खिलाफ संरक्षण की मांग पर एक विधि के रूप में-111. के बाद से, अंय अध्ययनों से सुरक्षात्मक ऑक्साइड (पेो) और पाली-एल लैक्टिक एसिड (PLLA) के शामिल बहुलक मिश्रणों की जांच की है, के लिए एंटीवायरल और गर्भनिरोधक एजेंटों के स्वरित्र रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए एचआईवी-1 रोकथाम और इन विट्रो में गर्भनिरोधक 12. अतिरिक्त अध्ययन EFs की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है निंनलिखित प्रदान करने के लिए: छोटे अणु antivirals14, मजबूत और लचीले यांत्रिक गुणों20, 3-डी डिलिवरी आर्किटेक्चर21 के लंबे समय तक जारी , शुक्राणु प्रवेश12के निषेध, और अन्य वितरण प्रौद्योगिकियों के साथ विलय करने की क्षमता13. अंत में, पिछले काम आम सह संक्रामक वायरस, एचएसवी-2 और एचआईवी-114के खिलाफ एंटीवायरल एजेंटों के निरंतर वितरण के लिए पॉलिमर फाइबर का मूल्यांकन किया गया है । इस अध्ययन में, बहुलक फाइबर 1 महीने तक के लिए अपनी संरचना को बनाए रखने और वायरल प्रविष्टि के लिए एक शारीरिक बाधा प्रदान करके एंटीवायरल प्रसव के लिए पूरक गतिविधि प्रदान की है । इन परिणामों से, यह देखा गया कि EFs दोनों शारीरिक और रासायनिक वायरस संक्रमण में बाधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जबकि स्वरित्र रिलीज गुण बहुलक efs microbicide वितरण के लिए एक आकर्षक वितरण मंच बनाने के लिए, EFs अंय अनुप्रयोगों में विकसित किया गया है सतह संशोधित मचान7के रूप में सेवा । EFs extracellular मैट्रिक्स (ECM) की आकृति विज्ञान की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अक्सर पाड़ के रूप में कार्य करने के लिए सेलुलर पुनर्जनन22सुधार, और ऊतक इंजीनियरिंग में उनकी उपयोगिता को बढ़ाने23,24. ऐसे पाली-ε-caprolactone (PCL) और PLLA के रूप में पॉलिमर के शामिल तंतुओं वृद्धि कारकों और प्रोटीन electrospinning के बाद ECM वृद्धि हुई सेलुलर आसंजन और प्रसार सहित गुणों की तरह प्रदान करने के बाद के साथ सतह संशोधित किया गया है25 , 26. इसके अतिरिक्त, रोगाणुरोधी सतह संशोधित EFs विशिष्ट रोगजनक बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकने के लिए मूल्यांकन किया गया है27,28. इस बहुमुखी प्रतिभा और जैविक प्रभाव पैदा करने की क्षमता के कारण, EF प्रौद्योगिकी बहु-यंत्रवत कार्यक्षमता प्रदान करने के लिए क्षेत्रों की एक किस्म के पार का विस्तार करने के लिए जारी है । फिर भी, अनुप्रयोगों की विविधता में अपनी उपयोगिता के बावजूद, सतह को संशोधित फाइबर केवल हाल ही में microbicide क्षेत्र में पता लगाया गया है29।
समानांतर में नए वितरण प्रौद्योगिकियों के विकास को रोकने और एसटीआई के इलाज के साथ, उपंयास जैविक चिकित्सकीय विकसित किया गया है । सबसे होनहार microbicide उम्मीदवारों में से एक चिपकने वाला एंटीवायरल लेक्टिन, GRFT30है । मूलतः लाल शैवाल की एक प्रजाति से व्युत्पंन, GRFT एचआईवी के एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला के रूप में गतिविधि का प्रदर्शन किया है, एचएसवी-2, सार्स, साथ ही हेपेटाइटिस सी वायरस 31,३२,३३,३४ ३५ , ३६. वास्तव में, जैविक रूप से आधारित अवरोधकों के बीच, GRFT सबसे शक्तिशाली विरोधी एचआईवी गतिविधि है, एचआईवी को निष्क्रिय-1 लगभग तुरंत संपर्क करने पर30, जबकि स्थिरता और संस्कृति मीडिया की उपस्थिति में योनि से गतिविधि को बनाए रखने 10 दिनों तक के लिए रोगाणुओं३७। हाल ही में, एक ०.१% GRFT जेल intravaginal एचएसवी-2 चुनौती के खिलाफ चूहों की रक्षा के लिए दिखाया गया था, यह दोनों एचएसवी के खिलाफ संरक्षण की पहली पंक्ति के लिए एक होनहार उम्मीदवार बना-2 और एचआईवी-1३२, ३८. एचआईवी के लिए विशेष रूप से, GRFT शारीरिक रूप से बाध्यकारी gp120 या टर्मिनल mannose एन-वायरल लिफाफे पर जुड़े glycan अवशेषों द्वारा संक्रमण को रोकता है प्रवेश को रोकने के लिए३८,३९,४०,४१ ,४२. इस निषेध अत्यधिक प्रबल है, आईसी के साथ५०एस आ 3 एनजी/ एचआईवी संक्रमण को बाधित करने के अलावा, अध्ययनों से यह भी पता चला है कि GRFT वायरस की कोशिका के प्रसार में बाधा द्वारा एचएसवी-2 संक्रमण के खिलाफ की रक्षा करता है३२। सभी मामलों में, GRFT वायरल कणों को चिपकने वाला हो दिखाया गया है, जबकि विकार के लिए उच्च प्रतिरोध का प्रदर्शन । पिछले, GRFT Tenofovir (TFV) और अंय antivirals४४के संयोजन के साथ synergistic गतिविधि का प्रदर्शन किया है, यह संभव है और संभव सह EFs के साथ प्रशासन के लिए लाभप्रद बना । GRFT के प्रबल गुण इसे एक उत्कृष्ट जैव-आधारित एंटीवायरल उंमीदवार बनाते हैं, जिसमें EF टेक्नोलॉजी के साथ डिलीवरी को बढ़ाया जा सकता है ।
GRFT के चिपकने वाला और सहज एंटीवायरल गुणों के इस ज्ञान का उपयोग, एक बहुलक फाइबर पाड़ डिजाइन किया गया था, कि इन गुणों को एकीकृत वायरस प्रविष्टि के पहले परत29प्रदान करते हैं । रास्ते में प्रेरणा ढूंढना है कि cervicovaginal बलगम mucoadhesive mucin बातचीत के माध्यम से मुख्य रूप से वायरस के परिवहन में बाधा, हम परिकल्पना की है कि एक पाड़ और GRFT, एक उच्च घनत्व के साथ सतह को संशोधित covalently के रूप में EFs का उपयोग करके भूतल-संयुग्मित GRFT दुर्बल और अपने entrypoint४५,४६,४७पर वायरस निष्क्रिय होगा । यहाँ EFs एक प्रोटीन आधारित, वायरल चिपकने वाला बैरियर मंच को निष्क्रिय प्रदान करने के लिए एक स्थिर पाड़ के रूप में विकसित किया गया । हम एक के साथ GRFT के शक्तिशाली एंटीवायरल गुण गठबंधन की मांग की, संगत, परिवर्तनीय, और टिकाऊ बहुलक मंच, एक उपंयास वायरस “जाल बनाने के लिए.”
इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए, PLGA के शामिल तंतुओं electrospun थे, और EDC-एन एच एस रसायन को बाद में GRFT के साथ EF सतह को संशोधित किया गया । PLGA एक मॉडल electrospinning४८में अपने व्यापक उपयोग के कारण बहुलक के रूप में सेवा की, अपनी असंगति और लागत प्रभावशीलता के साथ संयुक्त । इसके अतिरिक्त, सतह संशोधन EFs के बड़े सतह क्षेत्र कारनामे, और एक उपयोगी विकल्प है कि encapsulation के साथ जोड़ा जा सकता है फाइबर उपयोगिता४९अधिकतम प्रदान करता है । पारंपरिक encapsulation तरीकों के विपरीत जहां GRFT का केवल एक हिस्सा उपलब्ध है (और केवल क्षणिक FRT में मौजूद), सतह संशोधन GRFT के उपचार की पूरी अवधि के दौरान अधिकतम करने के लिए अधिक से अधिक गतिविधि बनाए रखने के लिए सक्षम हो सकता है । इसके अलावा, प्रोटीन के रूप में हाइड्रोफिलिक यौगिकों के शामिल करने, पारंपरिक electrospinning तरीकों से, कम encapsulation क्षमता और प्रोटीन गतिविधि की हानि में परिणाम हो सकता है५०। इसलिए, GRFT सतह संशोधित फाइबर एक आशाजनक वैकल्पिक वितरण विधि है कि अकेले या संयोजन में electrospinning के साथ STI संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पेशकश कर सकते हैं ।
Protocol
1. Electrospun फाइबर पाड़ की तैयारी और निर्माण
सावधानी: सभी सॉल्वैंट्स या बहुलक समाधान के साथ काम एक रासायनिक धुएं डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल प्रारंभ करने से पहले प्रत्येक…
Representative Results
Discussion
उनके असुरक्षित संरचनाओं और बड़े सतह क्षेत्रों के कारण, EFs स्वास्थ्य में आवेदनों की एक किस्म है, जिनमें से एक चिकित्सकीय प्रसव के वाहनों के रूप में सेवारत शामिल पाया है । दवाओं और अन्य सक्रिय एजेंटों स्व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए उत्कृष्टता के लिए यहूदी विरासत कोष के लिए आभारी हैं । हम उदारता से electrospinning प्रणाली के उपयोग प्रदान करने के लिए डॉ स्टुअर्ट विलियंस द्वितीय धंयवाद । हम भी Griffithsin के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ केनेथ पामर धंयवाद । हम इसके अलावा GRFT एलिसा काम में हमें प्रशिक्षण के लिए डॉ Nobuyuki Matoba और उनकी प्रयोगशाला का धंयवाद ।
Materials
| Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
| Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
| Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |
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