Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual
Summary
Este manuscrito describe el procedimiento para fabricar y caracterizar fibras de electrospun modificado Griffithsin poli (ácido láctico-co-glicólico) que muestran potente actividad adhesiva y antiviral contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 en vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar superficie, caracterizar la morfología resultante, Conjugación, y se describen desorción de Griffithsin de fibras de superficie modificada.
Abstract
Electrospun fibras (EFs) han sido ampliamente utilizadas en una variedad de aplicaciones terapéuticas; sin embargo, sólo recientemente aplicados como una tecnología para prevenir y tratar sexualmente transmitidas (ETS). Además, muchas tecnologías EF se centran en encapsular al agente activo, en relación con la utilización de la superficie para impartir biofunctionality. Aquí se describe un método para fabricar y superficie-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, con las lectinas antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA es un polímero aprobado por la FDA que ha sido ampliamente utilizado en la administración de fármacos debido a sus excelentes propiedades químicas y biocompatibles. GRFT es un natural, potente y seguro lectina que posee actividad amplia contra numerosos virus incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuando se combinan, las fibras modificadas GRFT han demostrado potente inactivación del VIH-1 en la vitro. Este manuscrito describe los métodos para fabricar y caracterizar EFs GRFT modificado. En primer lugar, PLGA es electrospun crear un andamio de fibra. Las fibras son posteriormente modificado de superficie con GRFT usando 1-etil – 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y la química de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para evaluar el tamaño y la morfología de las formulaciones de superficie modificada. Además, un gp120 o hemaglutinina (HA)-ELISA de base puede utilizarse para cuantificar la cantidad de GRFT conjugada, así como desorción GRFT desde la superficie de la fibra. Este protocolo puede aplicarse más ampliamente para fabricar fibras que son modificados por la superficie con una variedad de proteínas diferentes.
Introduction
El uso de EFs como una plataforma de entrega tópica tiene el potencial para reducir significativamente las ITS. Actualmente, hay más 36 millones personas que viven con el VIH, con sobre 2 millones de nuevos casos reportados en 2015 solo1,2. Además, el virus herpes simple tipo 2 (HSV-2) la infección afecta cientos de millones de personas en todo el mundo y se ha demostrado para mejorar la adquisición del VIH por 2-5 veces3. Debido a esta relación entre infección por VHS-2 y la infección por el VIH, existe gran interés en el desarrollo de nuevos agentes activos que proporcionan la protección simultánea contra las ITS múltiples. Por otra parte, el desarrollo de nuevos vehículos para mejorar la entrega de estos agentes antivirales ofrece el potencial para aumentar la Potencia protectora y terapéutica. Hacia este objetivo EFs han sido investigados como una nueva plataforma para reducir la prevalencia de infecciones por el VIH-1 y HSV-2.
Durante las últimas dos décadas, EFs se han utilizado extensivamente en los campos de la administración de fármacos y tejidos ingeniería4. A menudo, polímeros biocompatibles se seleccionan traducir fácilmente a aplicaciones terapéuticas. Para fabricar el EFs poliméricos, el polímero seleccionado se disuelve en una solución acuosa o disolvente orgánica, dependiendo del grado de hidrofobicidad de polímero5. Agentes activos de interés entonces se agregan a la solución acuosa o disolvente antes del proceso de centrifugado eléctrico. La solución de polímero es entonces aspira en una jeringa y expulsada lentamente mientras sujeta a una corriente eléctrica. Este proceso típicamente resulta en fibras de polímero con hoja o macroestructuras cilíndrico (figura 1) y diámetros de fibra que van desde la micro a nano-escala6. Para aplicaciones más terapéuticas, agentes activos se incorporan dentro de las fibras durante el proceso de centrifugado eléctrico y son liberados de la fibra a través de la difusión y la degradación de fibra posterior. La tasa de degradación o de liberación puede ser alterada usando diferentes tipos de polímeros o mezclas de polímeros para establecer un perfil de liberación deseado, impartiendo propiedades químicas y físicas únicas7y la promoción de la encapsulación de prácticamente cualquier compuesto. Como tal, EFs han demostrado ser beneficiosos para la entrega de fármacos de molécula pequeña y agentes biológicos, como proteínas, péptidos, oligonucleótidos y factores de crecimiento6,8,9.
En el campo de la prevención de ITS, EFs han utilizado recientemente para incorporar y ofrecer o inducible-liberación sostenida de agentes antivirales10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. En uno de los primeros estudios, se desarrollaron fibras sensible al pH para liberar a agentes activos en respuesta a cambios ambientales dentro de la zona reproductiva femenina (FRT), como un método en demanda de protección contra el VIH-111. Desde entonces, otros estudios han investigado mezclas de polímero compuestos de óxido de polietileno (PEO) y el ácido poli-l-láctico (PLLA), para evaluar la liberación ajustable de agentes antivirales y anticonceptivos para VIH-1 prevención y anticoncepción in vitro 12. estudios adicionales han demostrado la viabilidad de EFs para proporcionar lo siguiente: prolongada liberación de pequeñas moléculas antivirales14, fuerte y flexible propiedades mecánicas20, arquitecturas de entrega 3-21 , inhibición de esperma penetración12y la capacidad para combinar con otras tecnologías de entrega13. Finalmente, el trabajo previo ha evaluado fibras poliméricas para la entrega sostenida de los antivirales contra el virus de co-contagioso comunes, HSV-2 y VIH-114. En este estudio, las fibras de polímero proporcionan actividad complementaria a la entrega de antiviral por su estructura de retención hasta por 1 mes y proporcionar una barrera física a la entrada viral. De estos resultados, se observó que la EFs pueden utilizarse tanto física como químicamente impedir la infección del virus.
Mientras que propiedades sintonizables poliméricos EFs una plataforma atractiva para la entrega de microbicidas, EFs se han desarrollado en otras aplicaciones como andamios de superficie modificada7. EFs se han utilizado para imitar la morfología de la matriz extracelular (ECM), actuando a menudo como andamios para mejorar la regeneración celular22y su utilidad en tejidos ingeniería23,24. Las fibras de polímeros como el poli-ε-caprolactone (LCP) y PLLA han sido superficie modificada con factores de crecimiento y proteínas después de electrospinning impartir propiedades de ECM como incluyendo aumento celular adherencia y proliferación25 , 26. Además, EFs modificado superficie antimicrobianas han sido evaluadas para prevenir el crecimiento de bacterias patógenas específicas27,28. Debido a esta versatilidad y la capacidad de inducir efectos biológicos, tecnología EF continúa expandiéndose a través de una variedad de campos para proporcionar funcionalidad de múltiples mecanismos. Sin embargo, a pesar de su utilidad en una diversidad de aplicaciones, fibras de superficie modificada sólo recientemente se han explorado en el campo microbicida del29.
En paralelo con el desarrollo de las nuevas tecnologías de entrega para prevenir y tratar las ITS, se han desarrollado novedosas terapias biológica. Uno de los candidatos más prometedores del microbicida es el adhesivo lectinas antiviral, GRFT30. Derivado originalmente de una especie de algas rojas, GRFT ha demostrado actividad como un potente inhibidor de la HIV, HSV-2, SARS, así como de la Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. de hecho, entre los inhibidores de base biológica, GRFT tiene la más potente actividad anti-VIH, inactivar el VIH-1 casi de inmediato en contacto30, manteniendo la estabilidad y la actividad en presencia de medios de cultivo de vaginal microbios por hasta 10 días37. Más recientemente, gel 0.1% GRFT fue demostrado proteger a ratones contra el desafío de HSV-2 intravaginal, convirtiéndolo en un candidato prometedor para la primera línea de protección contra HSV-2 y VIH-132, 38. para VIH GRFT inhibe específicamente, infección atando físicamente gp120 o terminal de residuos de glicanos N-ligados de manosa en las superficies de la envoltura vírica para prevenir la entrada de38,39,40,41 ,42. Esta inhibición es muy potente, con IC50s a 3 ng/mL43. Además de inhibir la infección por VIH, los estudios también han demostrado que GRFT protege contra la infección por HSV-2 inhibiendo la propagación de célula a célula del virus32. En todos los casos, GRFT ha demostrado ser adhesivo a partículas virales, demostrando alta resistencia a la desnaturalización. Por último, GRFT ha demostrado actividad sinérgica con combinaciones de Tenofovir (TFV) y otros antivirales44, lo que es factible y probable beneficioso administrar conjuntamente con EFs. Las potentes propiedades de GRFT hacen un excelente base biológica antiviral candidato, en el cual entrega puede mejorarse con la tecnología EF.
Utilizando este conocimiento de las propiedades antivirales de GRFT adhesivo e innatas, un andamio de fibra polimérica fue diseñado, que integra estas propiedades para proporcionar la primera capa de virus entrada inhibición29. Encontrando inspiración en el camino que moco cervicovaginal dificulta el transporte de virus principalmente a través de las interacciones de mucina mucoadherentes, presumimos con EFs como andamio y covalente modificando la superficie con GRFT, una alta densidad de conjugados con superficie GRFT debilitar e inactivar virus en su punto de entrada45,46,47. Aquí EFs se desarrollaron como un andamio fijo para proporcionar una viral, basada en la proteína adhesiva inactivar barrera plataforma. Intentamos combinar las potentes propiedades antivirales de GRFT con una plataforma de polímero biocompatible, modificable y durable, para crear un nuevo virus “trampa.”
Para alcanzar estos objetivos, las fibras de PLGA eran electrospun y química NHS EDC utilizó posteriormente modificar la superficie EF con GRFT. PLGA sirvió como un polímero del modelo debido a su amplio uso en electrospinning48, combinado con su biocompatibilidad y su rentabilidad. Además, modificación superficial explota la gran superficie de EFs y ofrece una alternativa útil que puede combinarse con la encapsulación para maximizar la utilidad de la fibra49. A diferencia de los métodos de encapsulación tradicionales donde solamente una porción de GRFT está disponible (y sólo transitoriamente presentes en la FRT), modificación superficial puede permitir GRFT mantener bioactividad máxima durante toda la duración del tratamiento. Además, la incorporación de compuestos hidrofílicos como proteínas por métodos tradicionales de electrospinning, puede resultar en rendimientos más bajos de la encapsulación y la pérdida de proteína actividad50. Por lo tanto, las fibras de superficie modificada GRFT pueden ofrecer un método prometedor de entrega alternativos que puede utilizarse solos o en combinación con electrospinning para optimizar la protección contra la infección de ITS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a sus estructuras porosas y superficies grandes, EFs han encontrado una variedad de aplicaciones en la salud, uno de los cuales incluye servir como vectores terapéuticos. Drogas y otros agentes activos pueden ser incorporados dentro de EFs para entrega regulable, mientras que los productos biológicos y químicos ligandos pueden ser conjugados con la superficie de la fibra para celular específica dirigida a52 o biosensores53. Aquí la fabricación de GRFT superfici…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al fondo de la judíos patrimonio por excelencia para la financiación de esta investigación. Agradecemos al Dr. Stuart Williams II para ofrecer generosamente el uso del sistema de centrifugado eléctrico. También agradecemos el Dr. Kenneth Palmer nos proporciona Griffithsin. Además agradecemos a Dr. Nobuyuki Matoba y su laboratorio para el entrenamiento en el ELISA GRFT trabajar.
Materials
| Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
| Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
| Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |
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