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Bioengineering

Fabrication et caractérisation des échafaudages de fibre Griffithsin modifiés pour la prévention des Infections sexuellement transmissibles

Published: October 31, 2017
doi:
10.3791/56492
, ,
1Department of Chemistry,University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine,University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville, 5Department of Bioengineering,University of Louisville

Summary

Cet article décrit la procédure pour fabriquer et caractériser les fibres électrofilées Griffithsin-modified poly (acide lactique-co-glycolique) qui démontrent une activité adhésive et antivirale puissante contre l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 in vitro. Méthodes utilisées pour synthétiser, surface-modifier et de caractériser la morphologie qui en résulte, conjugaison, et désorption de Griffithsin de surface-modifiée en fibres sont décrites.

Abstract

Fibres électrofilées (EFs) ont été largement utilisées dans une variété d’applications thérapeutiques ; Toutefois, elles ont récemment été appliquées comme une technologie pour prévenir et traiter sexuellement transmissibles (IST). En outre, beaucoup de technologies EF se consacrée sur encapsulant l’agent actif, par rapport à utilisant la surface pour donner biofunctionality. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer et surface-modifier poly(lactic-co-glycolic) acide (PLGA) électrofilées fibres, avec la lectine antivirale puissante Griffithsin (GRFT). PLGA est un polymère approuvé par la FDA qui a été largement utilisé dans l’administration de médicaments en raison de ses excellentes propriétés chimiques et biocompatibles. GRFT est un naturel, puissant, lectine sécuritaire qui possède une activité large contre de nombreux virus, y compris le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Lorsqu’il est combiné, fibres GRFT modifiés ont montré puissante inactivation du VIH-1 in vitro. Ce manuscrit décrit les méthodes permettant de fabriquer et de caractériser les EFs GRFT modifiés. Tout d’abord, PLGA est électrofilées pour créer un échafaudage de fibre. Les fibres ont été modifiés par la suite surface avec GRFT à l’aide de 1-éthyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et la chimie de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopie électronique (MEB) a été utilisé pour évaluer la taille et la morphologie des formulations à surface modifiée. En outre, une gp120 ou l’hémagglutinine (HA)-fonction ELISA peut être utilisée pour quantifier la quantité de GRFT conjugué à, ainsi que la désorption GRFT de la surface de la fibre. Ce protocole peut être plus largement appliqué pour fabriquer des fibres qui ont été modifiés par surface avec une variété de protéines différentes.

Introduction

L’utilisation d’EFs comme une plate-forme de livraison topique a le potentiel de réduire considérablement les IST. Actuellement, il y a plus 36 millions de personnes vivant avec le VIH, plus 2 millions de nouveaux cas signalés en 2015 seulement1,2. En outre, le virus de l’herpès simplex de type 2 (HSV-2) infection affecte des centaines de millions de personnes dans le monde entier et a été montré pour améliorer l’acquisition du VIH par 2-5 fois3. En raison de cette relation entre l’infection par HSV-2 et le VIH, il y a intérêt significatif dans le développement de nouveaux agents actifs qui assurent la protection simultanée contre plusieurs ist. En outre, le développement de nouveaux véhicules pour améliorer la prestation de ces agents antiviraux offre la possibilité de renforcer la puissance protectrice et thérapeutique. Pour atteindre ce but, l’EFs ont été étudiés comme une nouvelle plate-forme de livraison afin de réduire la prévalence des infections à VIH-1 et HSV-2.

Durant les deux dernières décennies, EFs ont été largement utilisés dans les domaines de l’administration de médicaments et ingénierie tissulaire4. Souvent, les polymères biocompatibles sont sélectionnés à traduire facilement aux applications thérapeutiques. Pour fabriquer des polymères EFs, le polymère sélectionné est dissoute dans une solution organique de solvant ou aqueuse, selon le degré de polymère hydrophobicité5. Principes actifs d’intérêt sont ensuite ajoutés à la solution de solvant ou aqueuse avant le processus d’électrofilage. La solution de polymère est ensuite aspirée dans une seringue et lentement éjectée tandis que soumis à un courant électrique. Ce processus entraîne généralement des fibres de polymère avec feuille ou cylindrique macrostructures (Figure 1) et fibre diamètres allant de l’ échelle micro à nano6. Pour des applications plus thérapeutiques, principes actifs sont incorporés dans les fibres au cours du processus d’électrofilage et sont libérés de la fibre par diffusion et de la dégradation de la fibre ultérieures. Le taux de dégradation ou de libération peut-être être modifié à l’aide de différents types de polymères ou de mélanges de polymères afin d’établir un profil de sortie désirée, conférant des propriétés chimiques et physiques uniques7et la promotion de l’encapsulation de n’importe quel composé. À ce titre, EFs sont révélés bénéfiques pour la livraison de médicaments à petites molécules et des agents biologiques, y compris les protéines, peptides, oligonucléotides et facteurs de croissance6,8,9.

Dans le domaine de la prévention des ITS, EFs ont été utilisés récemment d’intégrer et de fournir ou inductible-libération prolongée d’agents antiviraux10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Dans l’une des premières études, les fibres sensibles aux pH ont été développés pour libérer les principes actifs en réponse aux changements environnementaux au sein de l’appareil reproducteur féminin (FRT), comme une méthode de demande de protection contre le VIH-1,11. Depuis, d’autres études ont enquêté sur les mélanges de polymères composés d’oxyde de polyéthylène (PEO) et acide L-polylactique (PLLA), afin d’évaluer la libération accordable d’agents antiviraux et contraceptifs pour le VIH-1 prévention et contraception in vitro 12. d’autres études ont démontré la faisabilité de l’EFs pour fournir ce qui suit : prolonge la libération de petites molécules antiviraux14, forte et flexible de propriétés mécaniques20, livraison 3-d architectures21 , inhibition de sperme pénétration12et la capacité de fusionner avec d’autres technologies de livraison13. Enfin, les travaux précédents a évalué des fibres polymères pour la prestation soutenue d’agents antiviraux contre le virus co-contagieux communs, HSV-2 et le VIH-1,14. Dans cette étude, fibres de polymère fourni une activité complémentaire aux antiviraux livraison en conservant leur structure pendant environ 1 mois et en fournissant une barrière physique à l’entrée virale. D’après ces résultats, il a été observé qu’EFs peuvent être utilisés pour physiquement et chimiquement entraver d’infection par le virus.

Alors que libération accordable propriétés EFs polymériques une plateforme de livraison attractifs pour la livraison de microbicide, EFs ont été développés dans d’autres applications pour servir d’échafaudages à surface modifiée7. EFs ont été utilisées pour imiter la morphologie de la matrice extracellulaire (ECM), souvent en qualité d’échafaudages, d’améliorer la régénération cellulaire,22et leur utilité en tissu technique23,24. Les fibres composés de polymères tels que poly-ε-caprolactone (PCL) et PLLA ont été modifiés avec facteurs de croissance et de protéines de surface après électrofilage à conférer des propriétés de type ECM dont accrue adhérence et prolifération cellulaire25 , 26. en outre, EFs de surface-modifiée antimicrobiens ont été évaluées pour empêcher la croissance des bactéries pathogènes spécifiques27,28. En raison de cette polyvalence et la capacité d’induire des effets biologiques, technologie EF poursuit son expansion à travers une variété de domaines pour fournir des fonctionnalités multiples mécaniste. Pourtant, malgré leur utilité dans une diversité d’applications, fibres de surface-modifiée récemment ont été explorées dans le champ de microbicide29.

En parallèle avec le développement des nouvelles technologies de livraison pour prévenir et traiter les IST, nouvelles thérapies biologiques ont été développés. Un des candidats plus prometteurs de microbicides est l’adhésif lectine antivirale, GRFT30. À l’origine d’une espèce d’algues rouges, GRFT a démontré l’activité comme un puissant inhibiteur du HSV-2, le VIH, le SRAS, ainsi que de l’hépatite C virus31,32,33,34, 35 , 36. en effet, parmi les inhibiteurs à base de biologiquement, GRFT a la plus puissante activité anti-VIH, inactiver le VIH-1 presque immédiatement contact30, tout en maintenant la stabilité et l’activité en présence de milieux de culture de vaginale microbes pour jusqu’à 10 jours37. Plus récemment, un gel GRFT 0,1 % s’est avéré protéger les souris contre le HSV-2 intravaginaux, ce qui en fait un candidat prometteur pour la première ligne de protection contre l’HSV-2 et le VIH-1,32, 38. pour le VIH en particulier, GRFT inhibe l’infection en liant physiquement gp120 ou terminal résidus de N-liés glycane de mannose sur surfaces enveloppe virale pour empêcher l’entrée38,39,40,41 ,,42. Cette inhibition est très puissante, avec IC50s approchant de 3 ng/mL43. En plus d’inhiber l’infection par le VIH, les études ont également montré que GRFT protège contre l’infection à HSV-2 en inhibant la prolifération de cellule à cellule du virus32. Dans tous les cas, GRFT s’est avéré être l’adhésif des particules virales, tout en faisant preuve d’une résistance élevée à la dénaturation. Enfin, GRFT a démontré une activité synergique avec combinaisons de ténofovir (FPV) et autres antiviraux44, rend possible et probablement bénéfique d’administrer avec EFs. Les puissantes propriétés de GRFT rendent un excellent biologiquement basé antiviral candidat, dans laquelle la livraison peut être améliorée par technologie EF.

Grâce à cette connaissance des propriétés antivirales adhésives et innées de GRFT, un échafaudage de fibre polymère a été conçu, qui intègre ces propriétés pour fournir la première couche de virus entrée inhibition29. S’inspirer de la manière que cervicovaginales mucus empêche transport virus principalement grâce à des interactions de mucine muco, nous avons émis l’hypothèse qu’en utilisant EFs comme un échafaudage et modification par liaison covalente de la surface avec GRFT, une forte densité de GRFT surface conjugué s’affaiblissent et inactiver le virus à son point d’entrée45,46,47. Ici, EFs ont été élaborés comme un échafaudage fixe pour fournir une protéine virale inactivant adhésif barrière plateforme. Nous avons cherché à combiner les propriétés antivirales puissantes de GRFT avec une plate-forme de polymère biocompatible, modifiable et durables, pour créer un nouveau virus « piège ».

Pour atteindre ces objectifs, les fibres composés de PLGA étaient électrofilées et chimie EDC-NHS a été utilisé pour modifier ultérieurement la surface EF avec GRFT. PLGA a servi un polymère de modèle en raison de son utilisation étendue dans électrofilage48, combiné avec sa biocompatibilité et la rentabilité. En outre, la modification de surface exploite la grande surface du système EFs et offre une alternative intéressante qui peut être combinée avec l’encapsulation pour maximiser la fibre utilitaire49. Contrairement aux méthodes traditionnelles d’encapsulation où seulement une partie des GRFT est disponible (et seulement transitoirement présents dans le FRT), modification de surface peut permettre GRFT maintenir une bioactivité maximale pendant toute la durée du traitement. En outre, l’incorporation de composés hydrophiles comme les protéines, par des méthodes traditionnelles électrofilage risquez efficacité encapsulation inférieure et perte de protéine activité50. Par conséquent, fibres de surface-modifiée GRFT peuvent offrir une méthode de livraison alternative prometteuse utilisable seul ou en combinaison avec électrofilage pour augmenter la protection contre l’infection de la STI.

Protocol

1. préparation et Fabrication de l’échafaudage de fibre électrofilées attention : tous les travaux avec des solvants ou des solutions de polymères doivent être effectués sous une hotte chimique . Se reporter à la fiche signalétique de chaque réactif avant de commencer le protocole. à electrospin une solution de polymère de 3 mL 15 % w/w PLGA, pèse 720 mg de 50/50 poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA ; 0,55 à 0,75 dL/g, 31-57 kDa) dans un flacon de 10…

Representative Results

Morphologie de la fibre a un effet significatif sur la capacité du système EFs à surface modifiée pour fournir une protection contre les virus. Bien électrofilage est une procédure simple et pratique, des formulations de polymère non optimisé peuvent provoquer dans la morphologie des fibres irrégulières (Figure 5B-C). Altérations électrofilage conditions qui entraînent la formation de morphologies de tapis perlées ou amorphes, s…

Discussion

En raison de leurs structures poreuses et les grandes surfaces, EFs ont trouvé un large éventail d’applications en soins de santé, dont inclut la portion comme vecteurs thérapeutiques. Médicaments et autres principes actifs peuvent être incorporés au sein de l’EFs pour livraison accordable, tandis que des produits biologiques et chimiques ligands peuvent être conjugués à la surface de la fibre pour cellule spécifique ciblant52 ou biodétection53. Ici la fabri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants au Fonds du patrimoine juif d’Excellence pour le financement de cette recherche. Nous remercions le Dr Stuart Williams II offrant généreusement son utilisation du système électrofilage. Nous remercions également m. Kenneth Palmer pour nous avoir fourni Griffithsin. En outre, nous remercions m. Nobuyuki Matoba et son laboratoire pour la formation que nous dans la GRFT ELISA fonctionne.

Materials

Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
 Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00
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Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).
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