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Bioengineering

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

Published: October 31, 2017
doi:
10.3791/56492
, ,
1Department of Chemistry,University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine,University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville, 5Department of Bioengineering,University of Louisville

Summary

Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l’infezione di tipo 1 del virus dell’immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.

Abstract

Fibre elettrofilate (EFs) sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di applicazioni terapeutiche; Tuttavia, solo recentemente sono stati applicati come una tecnologia per prevenire e curare sessualmente trasmissibili (malattie sessualmente trasmissibili). Inoltre, molte tecnologie di EF concentrano sull’incapsulamento l’agente attivo, rispetto che utilizzano la superficie per impartire biofunzionalità. Qui descriviamo un metodo per fabbricare e superficie-modificare le fibre elettrofilate (PLGA) acidi poly(lactic-co-glycolic), con il potente antivirale lectin Griffithsin (GRFT). PLGA è un polimero approvato dalla FDA che è stato ampiamente utilizzato nella somministrazione di farmaci a causa di sue eccezionali proprietà chimiche e biocompatibile. GRFT è un naturale, potente, sicuro lectin che possiede vasta attività contro numerosi virus compreso il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Quando combinati, GRFT-modificato fibre hanno dimostrato potente inattivazione di HIV-1 in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e caratterizzare GRFT-modificato EFs. In primo luogo, PLGA è elettrofilate per creare un’impalcatura di fibra. Le fibre sono successivamente modificate in superficie con GRFT utilizzando 1-etil – 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide (EDC) e N-Idrossisuccinimide (NHS) chimica. Microscopia elettronica (SEM) è stato utilizzato per valutare la dimensione e la morfologia delle formulazioni modificate in superficie. Inoltre, un gp120 o emoagglutinina (HA)-ELISA base può essere usato per quantificare la quantità di GRFT coniugato a, come pure il desorbimento GRFT dalla superficie della fibra. Questo protocollo può essere applicato più ampiamente per fabbricare fibre che vengono modificate in superficie con una varietà di differenti proteine.

Introduction

L’utilizzo di EFs come una piattaforma di consegna attuale ha il potenziale per ridurre in modo significativo le malattie sessualmente trasmissibili. Attualmente, ci sono oltre 36 milioni persone affette da HIV, con oltre 2 milioni di nuovi casi segnalati nel 2015 solo1,2. Inoltre, virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infezione colpisce centinaia di milioni di persone in tutto il mondo e ha dimostrato di migliorare l’acquisizione dell’HIV da 2-5 volte3. A causa di questa relazione tra infezione HSV-2 e acquisizione di HIV, c’è notevole interesse nello sviluppo di nuovi agenti attivi che forniscono protezione simultanea contro più di malattie sessualmente trasmissibili. Inoltre, lo sviluppo di nuovi veicoli per migliorare l’erogazione di questi agenti antivirali offre il potenziale per migliorare ulteriormente la potenza protettiva e terapeutica. Verso questo obiettivo, EFs sono stati studiati come una nuova piattaforma di consegna per ridurre la prevalenza di infezioni da HIV-1 e HSV-2.

Durante le due decadi scorse, EFs sono stati ampiamente utilizzati nei campi della somministrazione di farmaci e di ingegneria del tessuto4. Spesso, polimeri biocompatibili sono selezionati per tradurre facilmente per applicazioni terapeutiche. Per fabbricare polimerici EFs, il polimero selezionato è disciolto in una soluzione acquosa o solvente organica, a seconda del grado di idrofobicità di litio5. Agenti attivi di interesse vengono quindi aggiunti alla soluzione acquosa o solvente prima del processo di elettrofilatura. La soluzione di polimero viene poi aspirata in una siringa e lentamente espulso mentre è soggetto ad una corrente elettrica. Questo processo normalmente produce fibre di polimeri con foglio o macrostrutture cilindrico (Figura 1) e diametri di fibra che vanno dai6ai micro-nano-scala. Per le applicazioni più terapeutiche, agenti attivi sono incorporati nelle fibre durante il processo di elettrofilatura e vengono rilasciati dalla fibra tramite diffusione e degradazione della fibra successive. Il tasso di degradazione o di rilascio può essere modificato utilizzando diversi tipi di polimeri o miscele di polimeri per stabilire un profilo di rilascio desiderata, impartendo le proprietà chimiche e fisiche uniche7e promuovere l’incapsulamento di praticamente qualsiasi composti. Come tale, EFs hanno dimostrato benefici alla consegna dei farmaci piccola molecola e agenti biologici tra cui proteine, peptidi, oligonucleotidi e fattori di crescita6,8,9.

Nel campo della prevenzione di STI, EFs sono stati recentemente utilizzati per incorporare e fornire o inducibile-rilascio prolungato di agenti antivirali10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In uno degli studi più in anticipo, fibre pH-sensible a reagire sono stati sviluppati per rilasciare agenti attivi in risposta ai cambiamenti ambientali all’interno del tratto riproduttivo femmina (FRT), come un metodo su richiesta di protezione contro l’HIV-111. Da allora, altri studi hanno studiato i miscugli di polimeri composto di ossido di polietilene (PEO) e acido poli-L-lattico (PLLA), per valutare il rilascio sintonizzabile di agenti antivirali e contraccettivi per HIV-1 prevenzione e contraccezione in vitro 12. studi supplementari hanno dimostrato la fattibilità di EFs per fornire la seguente documentazione: prolungato rilascio di piccole molecole antivirali14, forte e flessibile proprietà meccaniche20, architetture 3D consegna21 , inibizione di sperma penetrazione12e la capacità di fondersi con altre tecnologie di consegna13. Infine, il lavoro precedente ha valutato fibre polimeriche per la consegna di sostenuta degli agenti antivirali contro il virus co-infective comuni, HSV-2 e di HIV-114. In questo studio, fibre polimeriche fornito attività complementare alla consegna antivirale mantenendo la loro struttura per fino a 1 mese e fornendo una barriera fisica per entrata virale. Da questi risultati, è stato osservato che EFs può essere utilizzato sia fisicamente e chimicamente ostacolare l’infezione del virus.

Mentre rilascio sintonizzabile proprietà rendono polimerici EFs una piattaforma attraente recapito per la consegna di microbicida, EFs sono state sviluppate in altre applicazioni per servire come scaffold modificate in superficie7. EFs sono stati utilizzati per simulare la morfologia della matrice extracellulare (ECM), spesso agendo come scaffold per la rigenerazione cellulare22di migliorare e potenziare la loro utilità in tessuto ingegneria23,24. Fibre di polimeri come poli-ε-caprolattone (PCL) e PLLA sono state modificate in superficie con fattori di crescita e proteine dopo elettrofilatura per conferire proprietà simil-ECM cui adesione e la proliferazione cellulare aumentata25 , 26. Inoltre, EFs modificate in superficie antimicrobica sono state valutate per impedire la crescita di batteri patogeni specifici27,28. A causa di questa versatilità e la capacità di indurre effetti biologici, tecnologia EF continua ad espandersi attraverso una varietà di campi per fornire funzionalità di multi-meccanicistico. Eppure, nonostante la loro utilità in una varietà di applicazioni, fibre modificate in superficie solo di recente sono stati esplorati nel campo microbicida29.

In parallelo con lo sviluppo di nuove tecnologie per la distribuzione per prevenire e curare le malattie sessualmente trasmissibili, approcci terapeutici biologici sono stati sviluppati. Uno dei più promettenti candidati microbicida è l’adesivo lectina antivirale, GRFT30. Originariamente derivato da una specie di alghe rosse, GRFT ha dimostrato l’attività come un potente inibitore dell’HIV, HSV-2, SARS, così come l’epatite C virus31,32,33,34, 35 , 36. infatti, tra inibitori biologicamente-based, GRFT ha la più potente attività anti-HIV, inattivando HIV-1 quasi immediatamente al contatto30, mantenendo stabilità e attività in presenza di terreni di coltura da vaginale microbi per fino a 10 giorni37. Più recentemente, un gel GRFT 0,1% è stato indicato per proteggere i topi contro intravaginale sfida di HSV-2, che lo rende un candidato di promessa per la prima linea di protezione contro HSV-2 sia HIV-132, 38. per HIV in particolare, GRFT inibisce l’infezione legandosi fisicamente i residui di glycan N-collegati di mannosio gp120 o terminal su superfici di envelope virale per prevenire la voce38,39,40,41 ,42. Questa inibizione è altamente potente, con IC50s avvicina 3 ng/mL43. Oltre ad inibire l’infezione da HIV, studi hanno anche dimostrato che GRFT protegge contro l’infezione HSV-2 inibendo la diffusione della cellula–cellula del virus32. In tutti i casi, il GRFT ha dimostrato di essere adesivo di particelle virali, pur dimostrando elevata resistenza alla denaturazione. Ultima, GRFT ha dimostrato l’attività sinergica con combinazioni di Tenofovir (TFV) e altri farmaci antivirali44, rendendo fattibile e probabilmente utile per somministrare con EFs. Le potenti proprietà di GRFT rendono un eccellente candidato antivirale biologicamente-based, in cui la consegna può essere migliorata con tecnologia EF.

Utilizzando questa conoscenza delle proprietà adesive e innata antivirale di GRFT, un’impalcatura di fibra polimerica è stata progettata, che integra queste proprietà per fornire il primo strato di virus voce inibizione29. Trovare ispirazione nel modo che cervicovaginali muco ostacola il trasporto virus principalmente attraverso interazioni di mucina mucoadesive, abbiamo supposto che utilizzando EFs come un’impalcatura e covalenza modificando la superficie con GRFT, un’alta densità di superficie-coniugati GRFT sarebbe debilitano e inattivare il virus al suo entrypoint45,46,47. Qui EFs sono stati sviluppati come un ponteggio fisso per fornire una piattaforma virale, basato su proteine inattivanti adesivo barriera. Abbiamo cercato di combinare le potenti proprietà antivirali di GRFT con una piattaforma di polimero biocompatibile, modificabile e durevole, per creare un virus novello “trappola”.

Per raggiungere questi obiettivi, fibre composto da PLGA erano elettrofilate e chimica di EDC-NHS è stato utilizzato per modificare in seguito la superficie EF con GRFT. PLGA servito come un polimero modello dovuto il relativo uso esteso in elettrofilatura48, combinato con la sua biocompatibilità e rapporto costo-efficacia. Inoltre, modificazione superficiale sfrutta l’ampia superficie di EFs e fornisce un’alternativa utile che può essere combinata con incapsulamento per massimizzare la fibra utilità49. A differenza dei metodi tradizionali di incapsulamento dove solo una parte del GRFT è disponibile (e solo transitoriamente presenti nella FRT), modificazione superficiale può abilitare GRFT mantenere la massima bioattività durante tutta la durata del trattamento. Inoltre, l’incorporazione dei composti idrofili quali proteine, dai metodi tradizionali di elettrofilatura, potrebbero inferiore incapsulamento efficienze e perdita di proteina attività50. Di conseguenza, fibre di modificazione superficiale GRFT possono offrire un promettente metodo di consegna alternativo che può essere utilizzato da solo o in combinazione con elettrofilatura per migliorare la protezione contro l’infezione di STI.

Protocol

1. preparazione e montaggio dell’impalcatura di fibre elettrofilate Attenzione: tutti i lavori con solventi o soluzioni di polimero devono essere eseguiti in una cappa chimica . Vedere la scheda tecnica di sicurezza materiale di ciascun reagente prima di iniziare il protocollo. a electrospin una soluzione di polimero di 3 mL 15% w/w PLGA, pesare 720 mg di 50: 50 poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) in un flacone da 10 mL di scintillazione. Il…

Representative Results

Morfologia delle fibre ha un effetto significativo sulla capacità di modificazione superficiale EFs per fornire protezione contro i virus. Anche se elettrofilatura è una procedura semplice e conveniente, formulazioni polimeriche non ottimizzato possono provocare la morfologia delle fibre irregolari (Figura 5B-C). Alterazioni in condizioni di elettrofilatura che risultano nella formazione di morfologie di mat-come perline o amorfe, sono spes…

Discussion

Grazie alle strutture porose e grandi superfici, EFs hanno trovato una varietà di applicazioni nel settore sanitario, uno dei quali comprende che serve come veicoli di consegna terapeutico. Farmaci e altri agenti attivi possono essere incorporati all’interno di EFs per consegna sintonizzabile, mentre biologics e leganti chimici possono essere coniugati alla superficie della fibra per cellula-specifico targeting52 o biosensoristica53. Qui la fabbricazione di GRFT modificate…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati al fondo patrimonio ebraico per eccellenza per la ricerca di finanziamenti. Ringraziamo il Dr. Stuart Williams II per generosamente fornendo l’utilizzo del sistema di elettrofilatura. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Palmer per averci fornito con Griffithsin. Ringraziamo inoltre Dr. Nobuyuki Matoba e suo laboratorio per la formazione di che noi nell’ELISA GRFT lavorare.

Materials

Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
 Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00
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Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).
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