Tillverkning och karakterisering av Griffithsin modifierade Fiber ställningar för Prevention av sexuellt överförbara infektioner

Summary

Detta manuskript beskriver förfarandet för att fabricera och karaktärisera Griffithsin-modifierad poly (mjölksyra-co-glykolsyra) electrospun fibrer som visar potent självhäftande och antivirala aktivitet mot humant immunbristvirus typ 1 infektion in vitro. Metoder som används för att syntetisera, surface-ändra, och karakterisera den resulterande morfologin, konjugation, och desorption av Griffithsin från ytan-modifierade fibrer beskrivs.

Abstract

Electrospun fibrer (EFs) har använts i en mängd olika terapeutiska tillämpningar; de har dock nyligen tillämpats som en teknik för att förebygga och behandla sexuellt överförbara infektioner (STI). Dessutom fokuserar många EF teknologier på att kapsla in den aktiva agenten, i förhållande till utnyttja ytan för att förmedla biofunctionality. Här beskriver vi en metod för att fabricera och surface-ändra poly(lactic-co-glycolic) syra (PLGA) electrospun fibrer, med den potenta antivirala lektin Griffithsin (GRFT). PLGA är en FDA-godkända polymer som allmänt har använts i drogen leverans på grund av dess enastående kemiska och biokompatibla egenskaper. GRFT är en naturlig, potenta, och säker lektin som besitter bred aktivitet mot många virus inklusive humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1). Kombination, har GRFT-modifierade fibrer visade potent inaktivering av HIV-1 i vitro. Detta manuskript beskrivs metoderna för att fabricera och karaktärisera GRFT-modifierade EFs. Första är PLGA electrospun att skapa en fiber byggnadsställning. Fibrerna är därefter ytan modifierade med GRFT hjälp 1-etyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) och N-hydroxysuccinimide (NHS) kemi. Svepelektronmikroskopi (SEM) användes för att bedöma storlek och morfologi av surface-modifierade formuleringar. Dessutom en gp120 eller hemagglutinin (HA)-baserade ELISA kan användas för att kvantifiera mängden GRFT konjugerat till, liksom GRFT desorption från fiber yta. Detta protokoll kan tillämpas mer allmänt för att fabricera fibrer som är ytan-modifierad med en mängd olika proteiner.

Introduction

Användningen av EFs som en aktuell leveransplattform har potential att avsevärt minska könssjukdomar. För närvarande finns det över 36 miljoner människor lever med HIV, med över två miljoner nya fall av rapporterade i 2015 ensam^1,2. Dessutom, herpes simplex virus typ 2 (HSV-2) infektion drabbar hundratals miljoner människor över hela världen och har visat sig förbättra förvärvet av HIV av 2-5 gånger³. På grund av detta förhållande mellan HSV-2 infektion och HIV förvärv finns det betydande intresse i utvecklingen av nya verksamma ämnen som ger samtidigt skydd mot flera sexuellt överförbara sjukdomar. Utvecklingen av nya fordon att förbättra leveransen av dessa antivirala medel ger dessutom potential att ytterligare förbättra skyddande och terapeutiska potens. Mot detta mål, har EFs undersökts som en ny leveransplattform för att minska prevalensen av HIV-1 och HSV-2 infektion.

Under de senaste två decennierna, EFs har i stor utsträckning används i fälten av drogen leverans och tissue engineering⁴. Ofta, är biokompatibla polymerer valda för att enkelt översätta till terapeutiska tillämpningar. För att fabricera polymera EFs, löses valda polymeren i ett organiskt lösningsmedel eller vattenbaserad lösning, beroende på graden av polymer vattenavvisande egenskaper⁵. Ämnen av intresse läggs sedan till lösningsmedel eller aqueous lösningen före den electrospinning processen. Polymer lösningen är sedan aspirerade i en spruta och långsamt matas ut medan omfattas av en elektrisk ström. Denna process resulterar vanligtvis i polymer fibrer med blad eller cylindriska macrostructures (figur 1) och fiber diametrar alltifrån mikro – till nano-skala⁶. För mest terapeutiska tillämpningar, aktiva agenter införlivas inom fibrerna under processen electrospinning och frigörs från fiber via diffusion och efterföljande fiber nedbrytning. Graden av nedbrytning eller release kan ändras med hjälp av olika typer av polymerer eller polymera blandningar för att upprätta en önskad release profil, förmedla unika kemiska och fysikaliska egenskaper⁷, och att främja inkapsling av praktiskt taget alla sammansatta. Som sådan, har EFs visat positiva till leverans av småmolekylära läkemedel och biologiska agens inklusive proteiner, peptider, oligonukleotider och tillväxtfaktorer^6,8,9.

I fältet för STI prevention, har EFs nyligen använts att införliva och ge eller inducerbara-frisättning av antivirala medel^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19}. I en av de tidigaste studierna utvecklades pH-lyhörd fibrer för att frigöra ämnen som svar på förändringar i miljön inom den kvinnliga fortplantningsorganen (FRT), som på begäran en metod för skydd mot HIV-1-¹¹. Sedan, har andra studier undersökt polymerblandningar består av polyeten oxid (PEO) och poly-L-mjölksyra (PLLA), för att utvärdera avstämbara frisläppandet av antivirala och preventivmedel agenter för HIV-1 förebyggande och preventivmedel i vitro ¹². ytterligare studier har påvisat genomförbarheten av EFs att tillhandahålla följande: förlängd frisättning av liten molekyl antiviraler¹⁴, stark och flexibel mekaniska egenskaper²⁰, 3D-leverans arkitekturer²¹ , hämning av spermier penetration¹²och förmågan att gå samman med andra leverans teknik¹³. Slutligen har tidigare arbete utvärderat polymera fibrer för ihållande-leverans av antivirala medel mot gemensamma co-infective virus, HSV-2 och HIV-1-¹⁴. I denna studie som polymer fibrer kompletterande verksamhet till antivirala leverans behålla sin struktur för upp till 1 månad och tillhandahålla en fysisk viral inträdeshinder. Från dessa resultat konstaterades det att EFs kan användas till både fysiskt och kemiskt hindra virusinfektion.

Medan avstämbara release egenskaper gör polymera EFs en attraktiv plattform för mikrobicid leverans, har EFs utvecklats i andra program att fungera som surface-modifierade ställningar⁷. EFs har använts för att efterlikna morfologi av den extracellulära matrixen (ECM), ofta egenskap ställningar att förbättra cellulär förnyelse²²och förbättra deras användbarhet i tissue engineering^23,24. Fibrer som består av polymerer, såsom poly-ε-kaprolakton (PCL) och PLLA har ändrats av ytan med tillväxtfaktorer och proteiner efter electrospinning att ge ECM-liknande egenskaper inklusive ökad cellulär adhesion och spridning^{25 , 26}. Dessutom antimikrobiell yta-modifierade EFs har utvärderats för att förhindra tillväxt av specifika patogena bakterier^27,28. På grund av denna mångsidighet och förmåga att inducera biologiska effekter, fortsätter EF tekniken att expandera i en mängd olika fält att tillhandahålla flera mekanistiska funktioner. Trots deras nytta av en mångfald av program, har ännu, surface-modifierade fibrer endast nyligen undersökts i mikrobicid fält²⁹.

Parallellt med utvecklingen av nya delivery-teknologier för att förebygga och behandla sexuellt överförbara sjukdomar, nya biologiska behandlingar har utvecklats. En av de mest lovande mikrobicid kandidaterna är den självhäftande antivirala lektin, GRFT³⁰. Ursprungligen härstammar från en art av röda alger, GRFT har visat aktivitet som en potent hämmare av HSV-2, HIV, SARS, samt hepatit C virus^{31,32,33,34, 35 , 36}. I själva verket bland biologiskt-baserade hämmare, GRFT har den mest potenta anti-HIV-aktiviteten, inactivating HIV-1 nästan omedelbart vid kontakt³⁰, bibehållen stabilitet och aktivitet i närvaro av kultur media från vaginal mikrober för upp till 10 dagar³⁷. Mer nyligen, en 0,1% GRFT gel visades att skydda möss mot intravaginal HSV-2 utmaning, vilket gör det en lovande kandidat för den första raden av skydd mot både HSV-2 och HIV-1^{32, 38}. för HIV specifikt GRFT hämmar infektion genom fysiskt bindande gp120 eller terminal mannos N-länkade glycan rester på virala kuvert ytor att förhindra inträde^{38,39,40,41 ,42}. Denna hämning är mycket potent och med IC₅₀s närmar sig 3 ng/mL⁴³. Förutom att hämma HIV-infektion, har studier också visat att GRFT skyddar mot HSV-2 infektion genom att hämma cell till cell spridning av virus³². I alla fall, har GRFT visat sig vara självhäftande viruspartiklar, samtidigt som vi visar hög motståndskraft mot denaturering. Senast, har GRFT visat synergistisk aktivitet med kombinationer av Tenofovir (TFV) och andra antivirala medel⁴⁴, gör det möjligt och sannolikt fördelaktigt att administrera tillsammans med EFs. GRFT potent egenskaper gör det en utmärkt biologiskt-baserade antivirala kandidat, där leverans kan förstärkas med EF-teknik.

Utnyttja denna kunskap för självhäftande och medfödda antivirala egenskaperna för GRFT, utformades en polymera fiber byggnadsställning som integrerar dessa egenskaper för att ge det första lagret av viruset inträde hämning²⁹. Att hitta inspiration i det sättet att cervicovaginal slem hindrar virus transport främst genom mucoadhesive mucin interaktioner, hypotesen vi som genom att använda EFs som en byggnadsställning och kovalent ändra ytan med GRFT, en hög täthet av Surface-konjugerad GRFT skulle försvaga och inaktivera virus på dess entrypoint^45,46,47. Här utvecklades EFs som en stationär byggnadsställning tillhandahålla en protein-baserade, viral lim-inactivating barriär plattform. Vi försökt kombinera potenta antivirala egenskaperna för GRFT med en biokompatibel, modifierbara och slitstark polymer plattform, att skapa en nya viruset ”fälla”.

För att uppnå dessa mål, fibrer består av PLGA var electrospun och EDC-NHS kemi användes för att därefter ändra EF ytan med GRFT. PLGA tjänade som en modell polymer på grund av dess omfattande användning i electrospinning⁴⁸, kombinerat med dess biokompatibilitet och kostnadseffektivitet. Dessutom ytmodifiering utnyttjar den stora ytan av EFs och ger ett användbart alternativ som kan kombineras med inkapsling att maximera fiber verktyget⁴⁹. Till skillnad från traditionella inkapsling metoder där endast en del av GRFT är tillgängliga (och endast övergående presentera i FRT), kan ytmodifiering aktivera GRFT att upprätthålla maximal bioaktivitet under hela behandlingen. Dessutom kan införlivandet av hydrofil föreningar såsom proteiner, av traditionella electrospinning metoder, resultera i lägre inkapsling effektivitetsvinster och förlust av protein aktivitet⁵⁰. GRFT yta-modifierade fibrer kan därför erbjuda en lovande alternativa leveranssätt som kan användas ensamt eller i kombination med electrospinning för att förbättra skyddet mot STI infektion.

Protocol

1. beredning och tillverkning av Electrospun Fiber ställningen försiktighet: allt arbete med lösningsmedel eller polymerlösningar bör utföras i dragskåp kemisk . Hänvisa till material säkerhetsdatablad av varje reagens innan protokollet. Att electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer lösningen, väger 720 mg 50: 50 poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA; 0,55 till 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i en 10 mL injektionsflaska av scintillation. Volymen av lösningen baseras på t…

Representative Results

Fiber morfologi har en betydande effekt på ytan-modifierade EFs förmåga att ge skydd mot virus. Även om electrospinning är en bekväm och okomplicerad procedur, kan icke-optimerade polymer formuleringar resultera i oregelbunden fiber morfologi (figur 5B-C). Förändringar i electrospinning tillstånd som resulterar i bildandet av pärlstav eller amorfa morfologier matta-liknande, orsakas ofta av lösningsmedel-polymer oförenlighet, låg…

Discussion

På grund av sin porösa strukturer och stora ytor, har EFs funnit en mängd olika applikationer inom vården, varav den ena innehåller servering som terapeutiska leveransfordon. Narkotika och andra ämnen kan införlivas inom EFs för avstämbara leverans, medan biologiska och kemiska ligander kan vara konjugerat till fiber ytan för cell-specifika inriktning⁵² eller biosensing⁵³. Här modifierade tillverkning av GRFT yta PLGA EFs, som en leverans byggnadsställning att f…

Materials

Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50	Lactel	B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Scientific	147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2	Brico Medical Supplies	BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip	VWR	309657
Parafilm (plastic film)	Sigma Aldrich	P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)	Sigma Aldrich	M3671
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662
Hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
2-Mercaptoethanol	Fisher	BP176
Griffithsin (GRFT)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide	Milipore	317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)	Sigma Aldrich	P9416
Tris EDTA Buffer	Sigma Aldrich	93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates	Thermo Scientific	3355
Influenza Hemagglutinin (HA)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)	Santa Cruz	2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-00