미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류
Summary
이 프로토콜에는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드와 세포 신호 캐스케이드 인 단백질의 지 방화를 평가 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) 미토 콘 드리 아 게놈의 다른 알려진된 유전자 내의 작은 열려있는 독서 프레임으로 인코딩됩니다 펩 티 드의 새로운 클래스는. MDPs는 apoptosis에서 신경 세포를 보호, 개선 신진 대사 마커, 화학요법에서 세포를 보호 등 생물학적 효과의 다양 한이 있다. Humanin 발견 첫 번째 민주당 고 민주당 가족 중 가장 공부 펩 티 드 이다. 막 수용 체와 humanin의 하류 신호 경로 신중 하 게 특징 되었습니다. 태그 c와 SHLP1-6 등 추가 MDPs 최근에 발견 되었습니다 고 신호 메커니즘 아직 해명 될. 여기이 펩 티이 드의 기능을 결정 하는 셀 문화 기반 방법을 설명 합니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 셀 분류 기법 활성화의 양적 결정 및 중요 한 신호 분자의 전 좌 허용. 세포 분별 법의 다른 방법이 있다, 하는 동안 여기에 설명 된 하나 쉽고 간단한 방법입니다. 이러한 방법은 더 명료이 펩 티이 드 및 다른 치료제의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.
Introduction
신흥 연구는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) cytoprotection 및 대사1,2,3중요 한 역할을 재생을 보여줍니다. 신호 변환 통로 MDPs의 존재 이해는 MDPs는 다양 한 기능을 조절 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 제공. 첫 번째 확인 된 민주당 humanin, extracellular 신호 통제 키 1/2 (ERK1/2)을 증가 표시 되었습니다4,5바인딩 그것의 수용 체를 통해 인 산화. 그러나, ERK1/2 활성화의 다운스트림 효과 여전히 underexplored.
ERK1/2 캐스케이드 다양 한 확산, 셀 이동, 세포 물질 대사, 생존, 및 apoptosis6,,78을 포함 하 여 세포질 과정에에서 필수적인 중재자 역할을 합니다. 모든을 통합 하는 것을이 다른 세포질 과정, 활동 및 ERK1/2의 subcellular 지 방화는 단단히 통제 가수분해 및 비 계 단백질9,10. 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 그것의 신호 기능, 활동, 및 특이성11,12조절 또한 ERK1/2의 동적 였죠. ERK1/2 주로 cytosol13에서 지역화 됩니다. 고정 및 비 계 단백질의 세트, 세포의 표면 또는 세포질13확산에 cytoskeletal 요소에 ERK1/2을 유지 도움이. 자극, ERK1/2은 phosphorylated 고 핵, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀14, 등 다른 subcellular 구획에 ERK1/2의 전 수 있도록 그 정박 단백질에서 해리 된다 15 , 16.
비록 humanin는 ERK1/2 신호 전달 경로 활성화, ERK1/2의 활성화만 총 세포 lysates에서 관찰 됩니다. ERK1/2 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과, 모두 subcellular 지 방화의 분석 및의 총 수준에 중요 한 역할 때문에 이전에 설명한 대로 phosphorylated ERK1/2는 포괄적인 이해를 제공 하는 데 필요한 ERK1/2 활성화 humanin 유도 및 다운스트림 목표의 활성화.
활성화 ERK1/2의 대상 세포를 이해 하려면 뒤에 phosphorylated ERK1/2 서 부 럽 subcellular 분류 수행 되었다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시 약 사용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 격리 된 subcellular 구획 straightforwardly 해석 결과 허용 하는 고 순도의 있습니다. ERK1/2 Immunostaining의 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 subcellular 구획은 상대적으로 시각화 하 고 특별 한 고정 및 permeabilization 방법이 필요로 어렵습니다. ERK1/2 레벨 subcellular 구획에 변화 하 고 전체 세포 lysates 볼 때이 변화 거짓 긍정과 거짓 부정적인 신호를 발생할 수 있습니다. 따라서, 격리 된 subcellular 구획을 사용 하 여 한 immunoblot 우리가 ERK1/2 지역화의 더 나은 이해를 제공 합니다.
방법의 다양성에 다른 MDPs 또는 STAT3 같은 다른 신호 분자의 전 좌를 포함 하 여 다른 자극의 효과 조사 하는 프로토콜의 수정 수 있습니다. 최근 발견 된 작은 humanin와 같은 펩 티 드 (SHLPs) 16S rRNA 지구 humanin 인코딩 및 HN17에 비해 유사 하지만 개별 속성에서 인코딩됩니다. 예를 들어 SHLP2 및 SHLP3에 8 h humanin 검토 다른 펩 티 드에 대 한 응답에서 ERK1/2의 subcellular 지 방화 5 분 이내 ERK1/2를 활성화 하는 있지만 우리가 줄 것 이다 이러한 펩 티이 드의 생물학의 더 나은 이해 후 ERK1/2를 활성화 해야 합니다. 증거를 신흥 신호 분자의 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과에 중요 한 역할을 담당 했다. 예를 들어, STAT3 전통적으로 주로 휴식 셀에 cytosol에서 지역화는 알려져 있으며 다음 응답 cytokines18으로 유전자 발현을 활성화 하는 핵으로 translocates. 또한 STAT3 미토 콘 드리 아를 translocates 하 고 TCA 주기 및 ATP 생산19. Autophagy 규제에 관한 STAT3의 다른 subcellular 지 방화 다양 한 방법으로20에서 autophagy를 조절 한다. 예를 들어 핵 STAT3 transcriptionally autophagy 관련 유전자를 조절 하 고 autophagy 변조기 역할. 세포질 STAT3 constitutively autophagy 신호 분자와 상호 작용 하 여 autophagy를 억제. 미토 콘 드 리아 STAT3 억제 하 고 산화 스트레스 유발 autophagy를 억제 하 여 mitophagy를 방지 합니다. 따라서,이 subcellular 구획 격리 방법은 다른 신호 분자로 ERK1/2의 역할을 이해 하기 위한 중요 한입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리가 보여주는 두 가지 서로 다른 세포 유형, 발생 하는 humanin 펩 티 드-중재 ERK1/2 활성화 및 활성화 ERK1/2의 subcellular 지 방화 (예를 들면, 펩 티 드, 시간 및 셀의 조건에 따라 다를 수 있습니다. 입력) 합니다. 그것은 보였다 그 humanin 두 개의 다른 수용 체22,23, humanin의 다른 복용량에 대 한 요구 사항 뿐 아니라 두 셀 라인 신호에 차이점을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 일 권, 노화 연구 프로그램에 엘리슨/멀리 박사 친교에 의해 지원 되었다 그리고 글렌 재단 수상 및 NIH PC에 부여 (1P01AG034906, 1R01GM 1R01ES 090311 020812). 모든 저자는 영화에 표시 됩니다.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
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