Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma
Summary
Bu iletişim kuralı, mitokondrial kaynaklı peptidler içeren hücreleri uyarmak ve sinyal cascade ve yerelleştirme fosfo-proteinlerin değerlendirmek açıklar.
Abstract
Mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP’ler) küçük açık okuma çerçevesi mitokondri genom kopyası bilinen diğer genler içinde tarafından kodlanmış peptidler yeni bir sınıf vardır. MDP’ler çok çeşitli nöronların apoptosis korumak, metabolik işaretçileri artırma ve kemoterapi hücrelerin korunması gibi biyolojik etkileri var. Humanin ilk MDP keşfedilmeyi ve en çok çalışılan peptid MDP aile arasında. Membran reseptörleri ve humanin aşağı akım sinyal yollar dikkatle karakterize. MOTS-c ve SHLP1-6 gibi ek MDP’ler daha Geçenlerde bulunduktan ve sinyal mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır zorunda. Burada Bu peptidler işlevini belirlemek için bir hücre kültür dayalı yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, hücre ayırma teknikleri, western Blot birlikte harekete geçirmek kantitatif tayin ve translocation önemli sinyal molekülünün için izin verir. Hücre ayırma başka yöntemler olmakla birlikte, burada açıklanan bir kolay ve basit yöntemdir. Bu yöntemler Bu peptidler ve diğer terapötik ajanlar etki mekanizması daha fazla aydınlatmak için kullanılabilir.
Introduction
Ortaya çıkan çalışmalar mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP’ler) cytoprotection ve metabolizma1,2,3‘ te önemli rol oynarlar göstermektedir. Sinyal iletim yolu MDP’ler huzurunda anlama bize hangi çeşitli işlevleri MDP’ler modüle mekanizması görmemizi sağlar. İlk tanımlanan MDP, humanin, hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz 1/2 (ERK1/2) artırmak için gösterilmiştir fosforilasyon, reseptör4,5bağlama aracılığıyla. Ancak, ERK1/2 aktivasyon aşağı akım etkisi hala underexplored.
ERK1/2 basamaklı hücresel süreçler yayılması, hücre göç, hücresel metabolizma, hayatta kalma ve Apoptozis6,7,8de dahil olmak üzere çeşitli önemli bir aracı olarak hizmet vermektedir. Tüm alacak için ayrı bu hücresel süreçler, aktivite ve ERK1/2 hücre altı yerelleştirme sıkıca fosfatazlar ve İskele proteinler9,10tarafından düzenlenmektedir. Translasyon modifikasyon ek olarak, dinamik ERK1/2 / mekik onun sinyal işlevi, aktivite ve özgüllük11,12düzenlemektedir. ERK1/2 öncelikle sitozol13‘ te lokalize edilmiştir. Ankraj ve İskele proteinler bir dizi yardımcı organelleri, yüzey veya dağınık sitoplazma13‘ te hücre iskeleti elemanları ERK1/2 korumak. Stimülasyon, üzerine ERK1/2 fosforile ve onun ankraj proteinler ERK1/2 translocation çekirdeği, mitokondri, Golgi ve organellerin14, de dahil olmak üzere diğer hücre altı bölmeleri için sağlayan ayrışmış olur 15 , 16.
Humanin ERK1/2 yolu sinyal etkinleştirmek için bilinen rağmen ERK1/2 aktivasyonu sadece toplam hücresini lysates görülmektedir. ERK1/2 hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkisi, hem hücre altı yerelleştirme analizi ve toplam düzeyde önemli bir rol oynar bu yana daha önce açıklandığı gibi fosforile ERK1/2 kapsamlı bir anlayış sağlamak için gerekli humanin kaynaklı ERK1/2 harekete geçirmek ve aşağı akım hedefleri aktivasyonu.
Aktif ERK1/2 hedef organelleri anlamak için hücre altı ayırma fosforile ERK1/2 için western Blot tarafından takip gerçekleştirildi. Standart laboratuar ekipmanları ve Kimyasalları kullanır gibi bu yöntem kolayca uygulanabilir. İzole hücre altı bölmeleri delikanlı yorumlanması için sonuçlar sağlayan yüksek saflık vardır. Immunostaining ERK1/2 benzer sonuçlara neden olabilir. Ancak, belirli hücre altı bölmeleri nispeten zor görselleştirmek ve özel fiksasyon ve permeabilization yöntemleri gerektirir. Hücre altı bölmeleri ERK1/2 düzeyleri farklılık ve bu değişim tüm cep telefonu lysates bakıldığında yanlış pozitif ve yanlış olumsuz sinyaller neden olabilir. Bu nedenle, bir immunoblot izole hücre altı bölmeleri kullanarak bize ERK1/2 yerelleştirme daha iyi bir anlayış verir.
Yöntem çok yönlülük değişiklikler diğer MDP’ler veya translocation ile STAT3 başka sinyal moleküllerin de dahil olmak üzere diğer uyarıcı etkilerini araştırmak için iletişim kuralı sağlar. Son zamanlarda keşfedilen küçük humanin benzeri peptidler (yelken) nerede humanin kodlanır ve onlar-si olmak benzer ancak farklı özellikleri HN17‘ ye göre 16S rRNA bölgesinden kodlanır. Örneğin, 5 dk. ERK1/2 İnceleme yanıt-e doğru farklı peptidler hücre altı yerelleştirme içinde ERK1/2 humanin etkinleştirir, ancak 8 h bize Bu peptidler Biyoloji daha iyi bir anlayış verir sonra SHLP2 ve SHLP3 ERK1/2 etkinleştirin. Kanıt ortaya çıkan sinyal molekülleri, hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkileri önemli bir rol oynar gösterdi. Örneğin, STAT3 geleneksel olarak öncelikle resting hücrelerdeki sitozol yerelleştirilecek bilinmektedir ve sonra gen ekspresyonu sitokinler18yanıt olarak etkinleştirmek için çekirdek içine translocates. STAT3 Ayrıca mitokondri için translocates ve TCA döngüsü ve ATP üretimi19düzenlemektedir. Autophagy Yönetmeliği ile ilgili çeşitli yolları20autophagy STAT3 farklı hücre altı yerelleştirme modüle. Örneğin, nükleer STAT3 transcriptionally autophagy ile ilgili genleri düzenler ve bir autophagy modülatör davranır. Sitoplazmik STAT3 moleküller sinyal autophagy ile etkileşerek autophagy yapısal engeller. Mitokondrial STAT3 engeller ve oksidatif stres indüklenen autophagy baskılayarak mitophagy engeller. Bu nedenle, bu hücre altı yuvası ayırma yöntemi diğer sinyal molekülleri yanı sıra ERK1/2 rolünün anlaşılması için önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz iki farklı hücre tiplerinde humanin peptid-aracılı ERK1/2 Etkinleştirme oluşuyor ve aktif ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu (örneğin, peptid, zaman nokta ve hücre doz koşullara bağlı olarak farklı olabilir gösterdi yazın). O humanin göstermiştir-sinyal içinde iki hücre hatları gibi farklı dozda kullanımının humanin gereksinimini farklılıkları açıklayabilir iki farklı reseptörleri22,23, sinyalleri. Bu fizyolojik …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bir Ellison/AFAR doktora sonrası bursu SJK için eskime araştırma programı tarafından desteklenen ve Glenn Vakfı Ödülü ve NIH verir PC için (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tüm yazarlar filmde görünür.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
