Methoden zur Analyse der Auswirkungen des natürlichen Urans auf In-vitro- Osteoclastogenesis
Summary
Uran ist bekannt, Knochenstoffwechsel beeinflussen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von natürlichem Uranexposition auf die Lebensfähigkeit, die Differenzierung und die Funktion der Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für Knochenabbau.
Abstract
Uran hat gezeigt, dass Knochen Physiologie stören und es ist allgemein bekannt, dass dieses Metall in den Knochen ansammelt. Jedoch ist wenig bekannt über die Wirkung des natürlichen Urans auf das Verhalten von Knochenzellen. Insbesondere ist die Wirkung von Uran auf Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für die Resorption der Knochenmatrix nicht dokumentiert. Um dieses Problem zu untersuchen, haben wir ein neues Protokoll mit Uranyl Acetat als Quelle des natürlichen Urans und murinen Zelllinie RAW 264,7 als Modell der Osteoklasten-Vorläufer etabliert. Hierin, detaillierte wir alle Tests erforderlich, um Uran Zytotoxizität auf Osteoklasten-Vorläufer zu testen und bewerten die Auswirkungen auf die Osteoclastogenesis und die resorbing Funktion der Reifen Osteoklasten. Die Bedingungen, die wir entwickelt haben, insbesondere für die Herstellung von Nährmedien Uranyl-haltigen und für die Aussaat des rohen 264,7 Zellen ermöglichen zuverlässige und hoch reproduktiver Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus haben wir den Einsatz von Software-Tools zur Erleichterung der Analysis verschiedener Parameter wie die Größe der Osteoklasten oder den Prozentsatz resorbiert Matrix optimiert.
Introduction
Uran ist ein natürlich vorkommendes radioaktives Element in Böden, Luft und Wasser vorhanden; Tiere und Menschen sind als solche Natururan in ihrer Ernährung ausgesetzt. Zusätzlich zu den natürlichen Quellen stammt Uran aus anthropogenen Aktivitäten erhöht seine Häufigkeit in der Umgebung. Uran stellt chemische und radiologische Gefahren. Jedoch weil natürliches Uran (das ist ein Isotopen Mischung mit 99.27 % 238U 0,72 % 235U und 0,006 % 234U) hat eine niedrige spezifische Aktivität (25.10.3 Bq.g-1), deren Auswirkungen auf die Gesundheit sind zurückzuführen auf seine chemische Toxizität.
Was auch immer seine Eintrag Route (Einatmen, verschlucken oder dermale Exposition), die meisten von Uran in den Körper eindringen mit Kot ausgeschieden ist und nur ein kleiner Teil erreicht den Körperkreislauf. Ca. 67 % des Urans im Blut wird wiederum durch die Nieren gefiltert und verlässt den Körper im Urin innerhalb 24 h1. Der Rest lagert sich vor allem in Nieren und Knochen, die zwei wichtigsten Zielorgane von Uran Toxizität2,3,4. Da das Skelett als der primäre Standort von Uran langfristige Aufbewahrung2,3,4,5,6identifiziert wurde, wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu erkunden die Wirkung von Uran auf Knochen Physiologie7.
Knochen ist ein mineralisierten Gewebe, die während seiner Lebensdauer kontinuierlich umgebaut ist. Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, der spezialisierte Zelltypen abhängig und besteht meistens aus zwei Phasen: Resorption von bereits vorhandenen alten Matrix durch Osteoklasten gefolgt von de-Novo-Knochen-Bau von Osteoblasten. Osteoklasten sind große Multikern Zellen, die aus der Verschmelzung von Vorläuferzellen hämatopoetischen Ursprungs, die zur Resorption Seiten wandern wo sie8Knochen zu befestigen. Ihre Befestigung erfolgt gleichzeitig mit eine umfassende Reorganisation der ihre Zytoskelett-9. Diese Reorganisation ist erforderlich für die Errichtung einer isolierten Fach zwischen der Zelle und der Knochenoberfläche, in denen die Osteoklasten Protonen sondert, führt zur Auflösung der Hydroxylapatit und Proteasen, die in den Abbau von, der organische Matrix. Die entstehenden Abbauprodukte sind Endocytosed, transportiert durch die Zelle, die Membranfläche gegenüber der Knochenoberfläche und abgesondert, einen Prozess namens Transcytosis10,11.
Ergebnisse von in Vivo und in Vitro Studien zeigen, dass Uran hemmt die Knochenbildung und die Anzahl und die Aktivität der Osteoblasten7,12 verändert. Im Gegensatz dazu haben die Auswirkungen von Uran auf Knochenabbau und Osteoklasten schlecht erforscht. Mehrere in-Vivo -Studien haben eine Verbesserung der Knochenabbau nach Verabreichung Uranyl Nitrat zu Mäusen oder Ratten13,14berichtet. Darüber hinaus schlug eine epidemiologische Untersuchung, dass die Zunahme der Uran-Aufnahme über das Trinkwasser tendenziell einen Anstieg der Serumspiegel eines Knochen-Resorption-Markers in Männer15zugeordnet werden. Zusammen genommen, diese Erkenntnisse führte zu dem Schluss, dass Uran, die reichert sich in Knochen Knochenabbau fördern könnte. Allerdings bleiben die zellulären Mechanismen beteiligt diese potenzielle Wirkung von Uran eine offene Frage. Aus diesem Grund haben wir beschlossen, die Auswirkungen von Uran auf Verhalten von resorbierbarem Knochenzellen zu untersuchen.
Hier beschreiben wir das Protokoll wir haben zur Charakterisierung und Quantifizierung der Auswirkungen des natürlichen Urans auf Pre Osteoklasten Lebensfähigkeit und Osteoklasten Differenzierung und resorptiven Aktivität. Die hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt mit RAW 264,7 murinen transformierten Makrophagen-Zelllinie, die können leicht unterscheiden in Osteoklasten wenn in Anwesenheit der Zytokin RANKL 4 oder 5 Tage lang kultiviert, und wird klassisch zu studieren Osteoklasten Differenzierung und Funktion16. Die entwickelten Verfahren sind zuverlässig, hoch reproduzierbare Ergebnisse und gelten uneingeschränkt für primäre Osteoklasten zu geben. Aus all diesen Gründen glauben wir, dass diese Methode für ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Toxizität von Uran in den Knochen immer nützlich ist. Darüber hinaus denken wir, dass dieser Ansatz als Screening-Instrument zur Identifizierung von neuen Uranium Komplexbildner angepasst werden könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Soweit wir wissen, ist dies das erste Mal, das ein detailliertes Verfahren mit dem Ziel, die Wirkung des natürlichen Urans auf Knochen resorbing Zellen untersuchen beschrieben wird. Dieser Ansatz wird nützlich sein, um ein besseres Verständnis der Uran-Auswirkungen auf die Physiologie des Knochens zu erreichen und bieten ein interessantes neues Tool für das Screening von Uran Chelatoren. Darüber hinaus glauben wir, dass das hier beschriebene Protokoll angewendet werden könnte, um die Auswirkungen von anderen Schwer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Chantal Cros für hilfreiche technische Unterstützung zu danken.
Diese Forschung wurde finanziert durch Zuschüsse aus den “Commissariat À Hang Atomique et Aux alternativen Energien” (URANOs – Programm transversale de Toxicologie du CEA und CPRR CEA-AREVA), und von ANR (Toxizität von Uran: Multi-level-Ansatz der Biomineralisation Prozess in Knochen, ANR-16-CE34-0003). Diese Arbeit wurde auch von der Universität Nizza Sophia-Antipolis und CNRS unterstützt.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
