Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis
Summary
Uranium is bekend dat het invloed op bot metabolisme. Hier presenteren we een protocol gericht op het onderzoeken van het effect van natuurlijk uranium blootstelling op de levensvatbaarheid, de differentiatie en de functie van osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk is voor bot resorptie.
Abstract
Uranium is aangetoond te bemoeien met bot fysiologie en het is reeds lang gevestigd dat dit metaal hoopt zich op in bot. Echter, er is weinig bekend over het effect van natuurlijk uranium op het gedrag van de cellen van het bot. In het bijzonder is het effect van uranium op osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk zijn voor de resorptie van de bot-matrix, niet gedocumenteerd. Om dit probleem nader te onderzoeken, hebben we een nieuw protocol met behulp van uranyl acetaat als een bron van natuurlijk uranium en de lymfkliertest cellijn van rauwe 264.7 als een model van osteoclast precursoren opgericht. We gedetailleerde hierin alle testen die nodig is voor het testen van uranium cytotoxiciteit op osteoclast precursoren en voor de evaluatie van de invloed ervan op de osteoclastogenesis op de resorbeerbare functie van volwassen osteoclasten. De voorwaarden die wij hebben ontwikkeld, met name voor de bereiding van de voedingsbodems uranyl-bevattende en voor het zaaien van rauwe 264.7 cellen toestaan om betrouwbare en zeer reproductieve resultaten te verkrijgen. Bovendien hebben we het gebruik van softwaretools om de analyse van de verschillende parameters zoals de grootte van de osteoclasten of het percentage van geresorbeerd matrix geoptimaliseerd.
Introduction
Uranium is een natuurlijk voorkomende radioactieve element aanwezig in de bodem, lucht en water; als zodanig, worden dieren en mensen blootgesteld aan natuurlijk uranium in hun dieet. Naast natuurlijke bronnen, is uranium afkomstig uit antropogene activiteiten, dat verhoogt de overvloed in de omgeving. Uranium vormt zowel chemische en radiologische risico’s. Echter, omdat natuurlijk uranium (dat is een isotopische mengsel met 99.27% 238U 0.72% 235U, en 0.006% 234U) heeft een lage specifieke activiteit (25.103 Bq.g-1), worden de effecten ervan op de gezondheid toegeschreven aan de chemische toxiciteit.
Wat de vermelding route (inhalatie, inslikken of dermale blootstelling), de meeste van uranium invoeren van het lichaam wordt geëlimineerd met uitwerpselen en slechts een klein gedeelte bereikt de systemische circulatie. Ongeveer 67% van uranium in het bloed is op zijn beurt gefilterd door de nieren en verlaat het lichaam in de urine binnen 24 h1. De rest wordt meestal gestort in de nieren en de botten, de twee voornaamste doelorganen van uranium toxiciteit,2,,3,4. Omdat het skelet heeft aangemerkt als de primaire site van uranium op lange termijn bewaring2,3,4,5,6, verschillende studies zijn uitgevoerd om te verkennen de effect van uranium op bot fysiologie7.
Bot is een gemineraliseerde weefsel dat is voortdurend gerenoveerd tijdens zijn levensduur. Het remodelleren van het bot is een complex proces dat afhankelijk van gespecialiseerde celtypen en bestaat meestal uit twee fasen: resorptie van de reeds bestaande oude matrix door osteoclasten gevolgd door de novo bot bouw van botcellen. Osteoclasten zijn grote multinuclear cellen als gevolg van de fusie van voorlopercellen van hematopoietische oorsprong die naar resorptie sites waar zij hechten migreren aan het bot van8. Hun gehechtheid vindt gelijktijdig plaats met een uitgebreide reorganisatie van hun cytoskelet9. Deze reorganisatie is vereist voor de totstandbrenging van een geïsoleerd compartiment tussen de cel en het oppervlak van de bot waarin de osteoclast protonen scheidt, wat leidt tot de ontbinding van hydroxyapatiet en proteasen die betrokken zijn bij de afbraak van de organische matrix. De resulterende afbraakproducten worden endocytosed, vervoerd door de cel naar het membraan gebied tegenover het bot oppervlak en uitgescheiden, een proces genaamd transcytosis10,11.
Resultaten van in vivo en in vitro studies blijkt dat uranium biomineralisatie remt en het nummer en de activiteit van botcellen7,12 wijzigt. In tegenstelling, hebben de effecten van uranium op bot resorptie en osteoclasten slecht onderzocht. Verschillende in vivo studies hebben gemeld een versterking van bot resorptie na toediening van uranyl nitraat naar muizen of ratten13,14. Een epidemiologisch onderzoek stelde voorts dat de toename van de uranium inname via drinkwater de neiging te worden geassocieerd met een toename van de serum-niveau van een bot resorptie markering in mannen15. Samen genomen, deze bevindingen leidde tot de conclusie dat uranium, dat zich in bot ophoopt bot resorptie kan bevorderen. De cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit potentiële effect van uranium blijven echter een open vraag. Om deze reden besloten hebben we te onderzoeken van het effect van uranium op gedrag van resorbeerbare bot cellen.
Hier beschrijven we het protocol die we hebben vastgesteld te karakteriseren en te kwantificeren van de effecten van natuurlijk uranium over pre osteoclasten levensvatbaarheid en differentiatie van osteoclasten en resorptive activiteit. De hierin beschreven proeven zijn gedaan met de RAW 264.7 lymfkliertest getransformeerde macrofaag cellijn, die gemakkelijk kan onderscheiden in osteoclasten wanneer gekweekt in aanwezigheid van de cytokine RANKL voor 4 of 5 dagen, en die is klassiek gebruikt om te studeren osteoclast differentiatie en functie16. De procedures ontwikkeld zijn betrouwbaar, zeer reproduceerbare resultaten en zijn volledig van toepassing op primaire osteoclasten geven. Om al deze redenen vinden wij dat deze methode handig is voor het verkrijgen van een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij uranium toxiciteit in bot. Bovendien denken wij dat deze aanpak aangepast als een screening tool worden kan voor het identificeren van nieuwe uranium chelaat agenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor zover we weten, is dit de eerste keer dat een gedetailleerde procedure gericht op het bestuderen van het effect van natuurlijk uranium op bot resorbeerbare cellen wordt beschreven. Deze aanpak nuttig zal zijn voor het bereiken van een beter begrip van uranium impact op bot fysiologie en een interessante nieuwe tool kan voorzien in de screening van uranium chelaatvormers. Wij zijn bovendien van mening dat het protocol hier beschreven kan worden toegepast om te bestuderen van de impact van andere zware metalen op oste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Chantal Cros voor nuttige technische bijstand.
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het “Commissariat à l’Energie Atomique et aux energieën alternatieven” (URANOs – programma transversale de Toxicology du CEA en CPRR CEA-AREVA), en van de ANR (toxiciteit van URanium: multi-level benadering van biomineralization verwerken in bot, ANR-16-CE34-0003). Dit werk werd ook ondersteund door de University of Nice Sophia-Antipolis en het CNRS.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
