培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法
Summary
ウランは、骨代謝に影響を与える知られています。ここでは、担当骨細胞破骨細胞の機能や分化、生存率に及ぼす天然ウランの影響の調査を目的としたプロトコルを提案する.
Abstract
骨生理学と干渉するウランが示されているし、この金属が骨に蓄積することは周知します。しかし、少しは天然ウランの骨細胞の挙動に及ぼす影響について知られています。特に、破骨細胞、細胞の骨基質の吸収のための責任のウランの影響は記載されていません。この問題を調べるためには、破骨細胞前駆体のモデルとして天然ウランのソースとマウスの未加工 264.7 のセル行酢酸ウランを使用して新しいプロトコルを定めています。ここで、破骨細胞の前駆物質のウランの細胞毒性をテストして、破骨細胞形成と破骨細胞の吸収機能にその影響を評価するために必要なすべてのアッセイを詳しく説明します。条件を開発した、特にウラン含有培地の調製および未加工 264.7 の播種細胞を信頼性が高く、高度生殖の結果を取得する許可。さらに、破骨細胞のサイズや堤吸収症マトリックスの割合など様々 なパラメーターの解析を容易にするソフトウェア ツールの使用を最適化します。
Introduction
ウランは天然に存在する放射性元素の土壌、空気、水の存在など、動物と人間は彼らの食事療法の自然なウランに公開されます。自然な源に加えてウランは環境の豊かさを高める人為的活動から起きる。ウランは化学と放射線の危険を引き起こします。ただしの場合 (これは同位体混合物含む 99.27 238U、0.72 235U、0.006 234U) 天然ウランは低特定活動 (25.103 Bq.g-1) があるのでその健康への影響に起因して、化学的毒性。
何その侵入経路 (吸入、摂取、または皮膚暴露)、ほとんど糞便と体内に侵入が排除されウランの小さい部分だけ全身循環に達する。血液中のウランの約 67% が腎臓によってフィルター処理順番と 24 h1尿中に肉体を離れます。残りは腎臓や骨、ウランの毒性2,3,4の 2 つの主なターゲット器官ほとんど堆積されています。探索するいくつかの研究が行われているスケルトンは、ウラン長期保持2,3,4,5,6のプライマリ サイトとして識別されている、ので、骨生理学7におよぼすウラン
骨は、その生涯を通じて継続的に改造は石灰化組織です。骨を改造する専門にされた細胞のタイプに依存し、ほとんどの 2 つのフェーズで構成されています複雑なプロセスである: 骨芽細胞による de novo 骨建設続いて既存の古い行列破骨細胞と骨吸収。破骨細胞は、8を骨に接続する吸収サイトに移行する原産の造血前駆細胞の融合から生じる大きな多核細胞です。愛着は、その骨格9の広汎な再編成と同時に発生します。この再編がセルとハイドロキシアパ タイトとの分解に関与するプロテアーゼの解散につながる陽子を分泌する破骨細胞を骨表面の間の分離されたコンパートメントの確立のために必要な有機マトリックス。結果として得られる劣化製品は貪食、骨表面の反対側膜領域にセルを経由、分泌、トランスサイトーシス10,11と呼ばれるプロセス。
体内と体外の調査からの結果を示すウランが骨形成を阻害して数と骨芽細胞7,12の活動を変化させます。対照的に、骨と破骨細胞に及ぼすウランは不十分な検討しています。いくつかの生体内での研究は、マウスやラット13,14硝酸ウラニル投与後骨吸収の強化を報告しています。さらに、疫学的調査は、飲料水経由でウラン摂取量の増加が男性15の骨吸収マーカーの血清レベルの増加に関連付けられている傾向があることを提案しました。一緒に取られて、これらの調査結果は、ウランは、骨に蓄積することが骨吸収を促進する結論に至った。しかし、ウランのこの潜在的な影響に関与する細胞のメカニズムは、未解決の問題を残る。このため、骨細胞を吸収に及ぼすウランの影響を調べることにしました
ここでは、設けてプロトコルについて述べるを特徴付ける、前破骨細胞の生存率と破骨細胞分化と吸収活性天然ウランの影響を定量化します。未加工 264.7 変換されたマクロファージ細胞ライン、これは容易に破 4 または 5 日間のサイトカイン RANKL の存在下で培養した場合に区別できるし、古典的な研究に用いられる実験記載が行われています。破骨細胞の分化および機能の16。開発手順は、信頼性の高い、再現性の高い結果とは完全に主要な破骨細胞を対象に与えます。これらすべての理由から、この方法論が骨におけるウランの毒性に関与する分子メカニズムのより良い理解を得ることに有用であると考えています。さらに、このアプローチは新しいウランのキレート剤を特定するためのスクリーニング ツールとして適応できると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 の知る限り、これは天然ウランの骨細胞に及ぼす影響を研究することを目指して詳細な手順が記載されている最初の時間です。この方法は骨生理学へのウランの影響のより良い理解を達成するために役に立つでしょう、ウランのキレート剤のスクリーニングのため興味深い新しいツールを提供することがあります。さらに、ここで説明されているプロトコル可能性があります osteoclatogene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、役に立つのテクニカル サポートにシャンタル Cro を感謝したいです。
この研究はからの補助金によって賄われていた、「兵站 à l’Energie Atomique et aux エネルギー代替”(URANOs – プログラム トランスバーサル ・ デ ・ Toxicologie ・ デュ ・ CEA と CPRR CEA アレバ)、ANR から (ウランの毒性: バイオミネラリゼーション マルチレベルのアプローチ骨、ANR-16-CE34-0003 で処理)。この作品は、CNRS ニース ・ ソフィア ・ アンティポリ大学によっても支えられました。
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
