Metoder för att analysera effekterna av naturligt uran på In Vitro Osteoclastogenesis
Summary
Uran är kända för att påverka benmetabolism. Här presenterar vi ett protokoll som syftar till att undersöka effekten av naturligt uran exponering på livskraft, differentiering och funktionen av osteoklasterna, cellerna som ansvarar för benresorption.
Abstract
Uran har visat sig störa ben fysiologi och det är klart fastställt att denna metall ackumuleras i ben. Men är lite känt om effekten av naturligt uran på uppförandet av benceller. I synnerhet är effekterna av uran på osteoklasterna, cellerna som är ansvariga för resorption av ben matrisen, inte dokumenterad. För att undersöka denna fråga, har vi etablerat ett nytt protokoll med uranyl acetat som en källa av naturligt uran och den murin cellinje-RAW 264,7 som en modell av osteoclast prekursorer. Häri, detaljerad vi alla de analyser som krävs för att testa uran cytotoxicitet på osteoclast prekursorer och utvärdera dess inverkan på osteoclastogenesis och resorbing fungera av mogna osteoklaster. Villkoren har vi utvecklat, i synnerhet för beredning av uranyl-innehållande kulturmassmedia och för odling av RAW 264,7 celler gör för att få tillförlitlig och mycket reproduktiv resultat. Dessutom har vi optimerat användningen av programvaruverktyg för att underlätta analysen av olika parametrar såsom storleken på osteoklaster eller andelen resorberas matris.
Introduction
Uran är ett naturligt förekommande radioaktivt grundämne som förekommer i jord, luft och vatten; som sådan, utsätts djur och människor för naturligt uran i sin kost. Förutom naturliga källor påbörjar uran från antropogena aktiviteter, vilket ökar dess överflöd i miljön. Uran medför både kemiska och radiologiska faror. Men eftersom naturligt uran (vilket är en isotopisk blandning innehållande 99,27% 238U och 0,72% 235U 0,006% 234U) har en låg specifik aktivitet (25,103 Bq.g-1), dess hälsoeffekter tillskrivs dess kemisk toxicitet.
Oavsett dess post rutt (inandning, förtäring eller dermal exponering), mest av uran kommer in i kroppen elimineras med avföring och endast en liten del når den systemiska cirkulationen. Cirka 67% av uran i blodet filtreras i sin tur av njurarna och lämnar kroppen i urin inom 24 h1. Resten är mestadels deponeras i njurar och ben, de två viktigaste målorganen av uran toxicitet2,3,4. Eftersom skelettet har identifierats som den primära platsen av uran långsiktiga retention2,3,4,5,6, flera studier har genomförts för att utforska den effekt av uran på ben fysiologi7.
Ben är en mineraliserad vävnad som är kontinuerligt renoverats under hela dess livstid. Benremodellering är en komplex process som beror på specialiserade celltyper och består mestadels av två faser: resorption av befintliga gamla matrisen av osteoklaster följt av de novo ben konstruktion av osteoblaster. Osteoklaster är stora multinukleära celler som härrör från fusionen av prekursorceller av hematopoetiska ursprung som migrerar till benresorption platser där de fäster ben8. Deras fastsättning sker samtidigt med en omfattande omorganisation av deras cytoskelettet9. Denna omorganisation krävs för inrättandet av en isolerad fack mellan cellen och benytan som utsöndrar osteoclast protoner, vilket leder till upplösningen av hydroxyapatit och proteaser deltar i nedbrytningen av den organisk matris. Resulterande nedbrytningsprodukterna är endocytosed, transporteras genom cellen till området membran motsatt benytan och utsöndras, en process som kallas transcytos10,11.
Resultat från in-vivo och in vitro- studier visar att uran hämmar benbildningen och ändrar antalet och aktiviteten av osteoblaster7,12. Effekterna av uran på benresorption och osteoklaster har däremot varit dåligt utforskat. Flera in-vivo studier har rapporterat en förbättring av benresorption efter administrering av uranyl nitrat till möss eller råttor13,14. Dessutom föreslagit en epidemiologisk utredning att ökningen av uran intag via dricksvattnet tenderade att vara förknippad med en ökning av serum nivån av benresorption markör i män15. Sammantaget dessa fynd ledde till slutsatsen att uran, som ackumuleras i ben kunde främja benresorption. De cellulära mekanismerna som är inblandade i denna potentiella effekt av uran är dock fortfarande en öppen fråga. Därför beslutade vi att undersöka effekterna av uran på uppförandet av resorbing benceller.
Här, vi beskriver de protokoll som vi har fastställt att karakterisera och kvantifiera effekterna av naturligt uran före osteoklaster livskraft och osteoklaster differentiering och resorberande aktivitet. De experiment som beskrivs häri har gjorts med RAW 264,7 murina transformerad makrofag cell-linjen, som lätt kan differentieras till osteoklaster när odlade i närvaro av cytokin RANKL för 4 eller 5 dagar, och som klassiskt används för att studera osteoclast differentiering och funktion16. De förfaranden som utvecklas är tillförlitliga, ge mycket reproducerbara resultat och är fullt tillämpliga på primära osteoklaster. Alla dessa skäl anser vi att denna metod är användbar för att få en bättre förståelse av molekylära mekanismer som är involverade i uran toxicitet i ben. Dessutom tror vi att denna metod kunde anpassas som en screeningmetod för att identifiera nya uran kelatbildare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Såvitt vi vet, är detta första gången som ett detaljerat förfarande som syftar till att studera effekten av naturligt uran på ben resorbing celler beskrivs. Detta tillvägagångssätt kommer att vara användbart att uppnå en bättre förståelse av uran inverkan på ben fysiologi och får ett intressant nytt verktyg för screening av uran kelater. Dessutom anser vi att det protokoll som beskrivs här kan tillämpas för att studera effekterna av andra tungmetaller på osteoclatogenesis.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Chantal Cros för bra tekniskt stöd.
Denna forskning finansierades genom bidrag från den ”Commissariat à l’Energie Atomique et aux energier alternativ” (URANOs – programmet övergripande de Toxicologie du CEA och CPRR CEA-AREVA), och från ANR (toxicitet av uran: multi-level tillvägagångssätt av biomineralization processen i ben, ANR-16-CE34-0003). Detta arbete stöddes också av universitetet i Nice Sophia-Antipolis och CNRS.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
