Metoder til at analysere virkningerne af naturligt uran på In vitro- Osteoclastogenesis
Summary
Uran er kendt for at påvirke ben stofskifte. Vi præsenterer her, en protokol med henblik på at undersøge effekten af naturligt uran eksponering på levedygtighed, differentiering og funktionen af osteoklaster, celler ansvarlig for knogleresorption.
Abstract
Uran har vist sig at blande sig med knogle fysiologi og det er velkendt, at denne metal ophobes i knogler. Dog er lidt kendt om effekten af naturligt uran på opførsel af knogleceller. Især er virkningen af uran på osteoklaster, de celler, der er ansvarlig for resorption af knoglematrix, ikke dokumenteret. For at undersøge dette spørgsmål, har vi etableret en ny protokol bruger uranyl acetat som en kilde til naturligt uran og RAW 264.7 murine cellelinie som en model af osteoklast prækursorer. Heri, detaljerede vi alle assays til at teste uran cytotoksicitet på osteoklast prækursorer og til at vurdere dens indvirkning på osteoclastogenesis og den resorbing funktion af modne osteoklaster. Betingelserne, vi har udviklet, navnlig forberedelsen af uranyl-holdige dyrkningsmedier og for såning af RAW 264.7 celler tillade for at opnå pålidelig og yderst reproduktive resultater. Derudover har vi optimeret brug af softwareværktøjer til at lette analysen af forskellige parametre som størrelsen af osteoklasterne eller procentdelen af resorberet matrix.
Introduction
Uran er en naturligt forekommende radioaktivt element findes i jord, luft og vand; som sådan, er dyr og mennesker udsat for naturligt uran i deres kost. Ud over naturlige kilder stammer uran fra menneskeskabte aktiviteter, som øger sin overflod i miljøet. Uran udgør både kemiske og radiologiske farer. Men fordi naturligt uran, (som er en isotopisk blanding indeholdende 99.27% 238U, 0,72% 235U og 0,006% 234U) har en lav specifik aktivitet (25.103 Bq.g-1), dens virkninger på sundhed tilskrives dens kemiske toksicitet.
Uanset hvad dens indfaldsvej (indånding, indtagelse eller dermal eksponering), de fleste af uran ind i kroppen er elimineret med afføring og kun en lille del når systemisk cirkulationen. Ca. 67% af uran i blodet filtreres igen af nyrer og forlader kroppen i urinen inden for 24 h1. Resten er for det meste deponeres i nyrer og knogler, de to vigtigste målorganer uran toksicitet2,3,4. Fordi skelettet er blevet identificeret som den primære lokalitet af uran langsigtede fastholdelse2,3,4,5,6, flere undersøgelser er blevet gennemført for at udforske den effekt af uran på knogle fysiologi7.
Bone er en mineraliseret væv, der er løbende ombygget i hele dens levetid. Knogle remodellering er en kompleks proces, der afhænger af specialiserede celletyper og består hovedsageligt af to faser: resorption af de allerede eksisterende gamle matrix af osteoklasterne efterfulgt af de novo knogle konstruktion af osteoblaster. Osteoklaster er store multinuclear celler som følge af en sammenlægning af forløber celler hæmatopoietisk oprindelsesregler, migrere til resorption steder hvor de tillægger knogle8. Deres tilknytning opstår samtidigt med en omfattende omorganisering af deres cytoskeleton9. Denne omlægning er nødvendig for oprettelsen af en isoleret rum mellem cellen og knoglen overfladen hvor osteoklast udskiller protoner, fører til opløsning af hydroxyapatit og proteaser involveret i nedbrydningen af den organiske matrix. De resulterende nedbrydningsprodukter er endocytosed, transporteres gennem celle til området membran over knoglen overfladen og udskilles, en proces kaldet transcytosis10,11.
Resultater fra i vivo og in vitro- undersøgelser viser, at uran hæmmer knogledannelse og ændrer antallet og aktivitet af osteoblaster7,12. Derimod har effekter af uran på knogleresorption og osteoklaster været dårligt udforskede. Flere i vivo undersøgelser har rapporteret en forøgelse af knogleresorption efter administration af uranyl nitrat til mus eller rotter13,14. Derudover foreslog en epidemiologisk undersøgelse, at stigningen i uran indtag via drikkevand tendens til at være forbundet med en stigning i serum niveau af en knogle resorption markør i mænd15. Taget sammen, disse resultater førte til den konklusion, at uran, som ophobes i knogler kunne fremme knogleresorption. De cellulære mekanismer involveret i denne potentielle effekt af uran er dog stadig et åbent spørgsmål. Derfor besluttede vi at undersøge virkningen af uran på opførsel af resorbing knogleceller.
Her, vi beskrive den protokol, vi har etableret at karakterisere og kvantificere effekterne af naturligt uran på pre osteoklaster levedygtighed og osteoklaster differentiering og resorptive aktivitet. Eksperimenter beskrevet heri har gjort med den RAW 264.7 murine transformerede makrofag cellelinie, som let kan differentiere i osteoklaster når kulturperler i overværelse af cytokin RANKL for 4 eller 5 dage, og som er klassisk bruges til at undersøge osteoklast differentiering og funktion16. Udviklet fremgangsmåder er pålidelige, giver meget reproducerbare resultater og er fuldt ud gældende for primære osteoklaster. Alle disse grunde mener vi, at denne metode er nyttig for at få en bedre forståelse af de molekylære mekanismer involveret i uran toksicitet i knoglen. Vi mener desuden, at denne tilgang kunne tilpasses som en screeningsværktøj til at identificere nye uran chelatdannere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Så vidt vi ved, er det første gang, at en detaljeret procedure med henblik på at studere effekten af naturligt uran på knogle resorbing celler er beskrevet. Denne tilgang vil være nyttigt at opnå en bedre forståelse af uran indvirkning på knogle fysiologi og kan give en interessant ny værktøj til screening af uran chelatorer. Derudover mener vi, at protokollen beskrevet her kunne anvendes til at undersøge virkningen af andre tungmetaller på osteoclatogenesis.
Det er kendt, at urany…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Chantal Cros hjælpsom teknisk bistand.
Denne forskning blev finansieret af tilskud fra den “Commissariat à l’Energie Atomique et aux energier alternativer” (URANOs – programmet tværgående de Toxicologie du CEA og CPRR CEA-AREVA), og fra ANR (toksicitet af uran: multi-level tilgang af biomineralization behandle i knoglen, ANR-16-CE34-0003). Dette arbejde blev også støttet af University of Nice Sophia-Antipolis og CNRS.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
