Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.
Abstract
Serum und Plasma Zelle freie DNA (Blut) wurde als informativen, nicht-invasive Quelle Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Vorhersage von Therapieresistenz gezeigt. Ausgehend von der Hypothese, dass die Androgen-Rezeptor (AR) gen Kopienzahl (CN) zu gewinnen ist ein häufiges Ereignis bei metastasiertem Kastration Widerstand Prostatakrebs (mCRPC), schlagen wir vor, dieses Ereignis im Blut als potenzielle prädiktive Biomarker zu analysieren.
Wir evaluierten AR CN im Blut mit 2 verschiedenen Echtzeit-PCR-Assays und 2 Referenz-Gene (RNaseP und AGO1). DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination verwendet. AR CN Gewinn wurde mit digitalen PCR als eine genauere Methode bestätigt. CN Variation Analyse bereits nachgewiesen, dass für die Vorhersage von Therapieresistenz in der Umgebung des mCRPC informativ sein, aber es könnte nützlich sein, auch für andere Zwecke in verschiedenen Patienten. CN-Analyse auf Blut hat mehrere Vorteile: Es ist nicht-invasiv, schnell und einfach durchzuführen, und es beginnt mit einem kleinen Volumen von Serum oder Plasma Material.
Introduction
Zirkulierenden Zelle freie DNA (Blut) im Blut nachgewiesen wurde eine optimale Quelle für Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Prognose der Behandlung Widerstand1,2. Viele Studien zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen DNA-Veränderungen (Mutationen, Kopie Nummer Variationen, epigenetische Veränderungen im Gewebe) und denen in entsprechenden Plasma Proben1, bestätigt, dass im Umlauf Tumor-DNA (CtDNA) informativ für Primär- und metastasiertem Tumor Gewebe Veränderungen3. Die Möglichkeit des Studiums CtDNA ermöglicht somit für den Wiederaufbau der genomic Rearrangements und Kopie Nummer Variationen (CNV) bei bestimmten Onkogene4Identifizierung potentiell metastasierendem klonale und subclonal Zellen. CtDNA hat sich gezeigt, zu klinisch nützlich vor allem für Krebs Behandlung überwachen, wie es bestimmte Mutationen und CNV, bezogen auf spezifische gezielte Therapien5,6birgt. Es überwindet die Notwendigkeit Gewebebiopsien und kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten während einer bestimmten Krebs-Behandlung in einer nicht-invasive Weise erzielten Ergebnisse.
In Bezug auf Prostata-Krebs, eine signifikante Korrelation zwischen zirkulierenden zellfreie Androgen Rezeptor (AR) CNV und Behandlung Antwort auf Abiraterone und Enzalutamid ist gezeigt worden, Anzeige AR gen Kopienzahl (CN) im Blut kann ein vielversprechender Biomarker zur Vorhersage Behandlung Widerstand7,8,9,10,11. CNV bestimmter Gene in CtDNA mit verschiedenen Vorgehensweisen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit, Kosten und Geschwindigkeit ausgewertet werden können (zB. in Echtzeit, digitale PCR und Next Generation Sequencing).
Hier beschreiben wir einen einfachen und schnellen Ansatz, basierend auf duplex-Assays in Echtzeit-PCR-Technologie für die Bewertung der AR CN in Blut, Serum und Plasma Proben7,8. Wir hielten zwei verschiedenen PCR-Assays entwickelt, auf zwei verschiedenen genomischen Regionen in Intron 5 AR (Xq12) und zwei andere Gene als interner standard Referenz Gene bekannt, um eine normale Nummer Kopierstatus bei Prostatakrebs (RNaseP, haben Das Hotel liegt auf 14q11; Vor1, befindet sich auf 1 s. 34). Wir haben zwei Referenz-Gene, anstatt ein, um die Präzision und Sensitivität der Ergebnisse zu erhöhen. Ein DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination (kombinierte Assay für AR-assay_1 + RNaseP und AR-assay_2 + AGO1) verstärkt. Drei Serum oder Plasma DNA-Proben von gesunden Männern wurden gebündelt und als ein Kalibrator verwendet. Wir hielten Abschaltungen von > 1,5 für AR Gewinn und < 0,5 für die Löschung. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es flexibel ist und dass auch andere Gene ausgewertet werden können, die internen Standardwerk Gene auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften ändern.
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Protocol
Das Protokoll besteht aus der Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma-Proben, Real-Time PCR für Kopie Zahlenanalyse durchzuführen. DNA-Extraktion, DNA-Menge Kontrolle (Spektralphotometer) und Real-Time PCR für spezifische Ziele wurden durchgeführt. In Abbildung 1eine Zusammenfassung der Verfahren und der Zeitleiste werden gemeldet.
Das Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Forschungsethikkommission IRST.
(1) Serum Erhebung und Verarbeitung
- Sammeln Sie etwa 5 mL Vollblut in einem Serum Röhrchen ohne Antikoagulans, Serum zu erhalten. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.
- Zentrifuge Rohre bei 1.000 x g für 15 min bei 4 ° C.
- Übertragen Sie in 2 mL Röhrchen Serum sorgfältig.
- Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.
(2) Plasma Erhebung und Verarbeitung
- Sammeln Sie etwa 10 mL Vollblut in einer Plasma-Röhre mit EDTA Plasma zu erhalten. Die Röhrchen vollständig füllen und es dann 8 Mal zu invertieren. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.800 x g für 15 min bei Raumtemperatur mit keine Einstellung "Bremse" auf der Zentrifuge.
- Übertragen Sie den oberen Teil des Plasmas in 2 mL Röhrchen vorsichtig. Wiederholen Sie die Übertragung, mindestens 1 mL des Überstands oberhalb der weißen Blutkörperchen-Ebene zu verlassen.
Hinweis: Übertragung den oberen Teil des Überstands reduziert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zellenrückstand. - Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.
3. DNA-Isolierung aus Serum oder Plasma
Hinweis: Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma sollte mit dem kommerziellen Protokoll geändert in den folgenden Schritten durchgeführt werden.
- Tauen Sie eine aliquote (mit 0,5 bis 2 mL) von Serum oder Plasma bei Raumtemperatur auf.
- Wirbel und mischen die Probe und 0,5 mL Serum oder Plasma in ein klares 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Den Rest des Materials bei-80 ° c eingefroren
- Fügen Sie 50 µL Proteinase k (20 mg/mL) direkt auf die Probe.
- Das Beispiel 0,5 mL Lyse Puffer hinzu und mischen Sie gut durch pipettieren.
- Schließen Sie die Rohre und inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 15 min in den Heizblock.
- Fügen Sie den angegebenen Betrag von 100 % Ethanol in Waschpuffer 1 und 2, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und geben Sie 0,5 mL absolutes Ethanol zu und mischen Sie gut durch pipettieren.
- Fügen Sie 650 µL der in Schritt 3.7 der Trennsäule und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min erhaltenen Mischung hinzu.
- Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und legen Sie die Spalte auf eine neue saubere Sammelröhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal.
- Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 1, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min Benetzung.
- Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.
- Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 2, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 3 min Benetzung.
- Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.
- Zentrifugieren Sie auf Hochtouren (20.000 x g) für 3 min um jede verbleibende waschen-Puffer zu entfernen.
- Legen Sie die Spalte in eine saubere 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 150 µL Elution Buffer und warten Sie 7 min um sicherzustellen, dass die Puffer die Spalte benetzt.
- 8.000 x g für 1 min zentrifugieren.
- Pipette Elute von 3.16 Schritt wieder in der gleichen Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 1 min um maximale Erholung von DNA zu gewährleisten.
4. DNA-Quantifizierung und Verdünnung
- Durchführen Sie Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie 2 µL Probe auf einem Benchtop-Spektralphotometer gemäß den Herstellerangaben.
Hinweis: Wenn die DNA-Menge mit Real-Time PCR Verfahren nicht ausreicht (mindestens 120 ng), führen Sie einen neuen DNA-Isolierung Prozess. - Verdünnen Sie DNA aus Serum oder Plasma zu 2,5 ng/µL in einem Endvolumen ausreichend für alle Echtzeit-PCR (ca. 50 µL).
(5) Real-Time PCR
- Tauen Sie Exemplar Nummer Assays, Referenz-gen-Test, DNA verdünnt Proben und Kalibratoren gebündelt im Eis auf. Equilibrate bei Raumtemperatur den master-Mix, der bei 4 ° c gelagert ist
- Bereiten Sie eine Mischung von 1 µL des Ziel-Assay, 1 µL des Referenz-Gen-Tests und 10 µL des master-Mix für 3 Wiederholungen für jede Probe und Kalibratoren gebündelt. Bereiten Sie die Mischung unter anderem eine Negativkontrolle (Wasser) und 2 zusätzliche Proben.
- In einem 96 well-Platte, aliquoten 12 µL des Mixes in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren.
- Fügen Sie 8 µL (Konzentration von 2,5 ng/µL) der einzelnen DNA-Probe und Kalibratoren gebündelt in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren. Die Tipp für jede Vertiefung zu ändern.
Hinweis: 30 DNA-Proben können verarbeitet werden, für jede Echtzeit-Experiment mit der 96-Well-Platte: 30 x 3 Proben + 1 x 3-Kalibratoren gepoolten + negative Kontrolle = 94. - Kurz spin-down der Platte bei 1.000 x g.
- Führen Sie die Platte über das folgende Protokoll: halten Bühne bei 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min.
6. Daten-Analyse und Interpretation
- Setzen Sie im Abschnitt "Option", unterhalb der Verstärkung Plot Ergebnisse den Ct-Schwellenwert bei 0,2 für das erste Zielgen analysiert. Wiederholen Sie den Satz für jedes Ziel oder Referenz-Gene. Wenn die Echtzeit-PCR-Datei in Erweiterung .txt exportieren möchten, drücken Sie "Export" in Symbolleiste. Markieren Sie nur "Ergebnisse" in der SELECT-Anweisung Daten → exportieren wählen Sie als Dateityp der Erweiterung .txt → Presse "Export starten" → schließen das Export-Tool.
- Öffnen Sie die Analysesoftware und importieren Sie die Datei .txt (Symbolleiste → Import).
- Wählen Sie den Namen der Datei zu analysieren und wählen die Analyse-Einstellung durch die Toolbar (Play-Symbol).
- Geben Sie der Kalibrator Probe und die bekannte Anzahl der Kopien des Ziels (z. B. 1 Kopie für AR -gen). Klicken Sie auf "anwenden".
- Lassen Sie für jede Probe einen Brunnen mit verschiedenen Delta Ct (ΔCt) im Vergleich zu anderen Brunnen.
- Das Experiment (Press Play-Symbol) zu diagnostizieren.
- Werten Sie die Ergebnisse durch die Kopienzahl bar Plot oder die Tabelle.
Hinweis: Die Ergebnistabelle enthält zahlreiche Parameter wie Vertrauen, Z-Score und Wiederholungen analysiert, die für die Interpretation der Ergebnisse nützlich sein könnte.
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Representative Results
Insgesamt Blut Konzentration wurde durch Spektralphotometrie für alle Proben analysiert, mit einem Median von 6,12 ng/µL quantifizierbare (Bereich: 2,00-23,71 ng/µL) für Serumproben und einem Median von 3,21 ng/µL (Bereich: 2,31-8,49 ng/µL) für Plasma-Proben. Wir haben insgesamt 115 Proben von Real-Time PCR Experimente analysiert.
Testsensitivität wurde bewertet mit gemischten Serum DNA von Patienten mit hohen oder niedrigen Gewinn für ARund DNA von gesunden Spendern, die auch als Kalibrator Proben für Kopie Zahlenanalyse verwendet werden. Wie in Abbildung 2dargestellt, wird AR CN ausreichend 0.375 % der DNA von Patienten mit AR plus gemischt mit gesunden Spenders DNA zu einem Gen Gewinn nachweisbar (Abbildung 2) erkannt. Dieser Ansatz erkannt somit eine sehr geringe Menge der Kopie Zahl gewinnen. Die Standardabweichung der ΔCt in CN Assays für jeden Patienten berechnet wurden (Median ± SD = 0,1, Reichweite: 0.00 - 0,36). Wir verwendet einen Median von die Standardabweichung der Werte für die Auswahl der Kopie Zahl Gewinn Cutoff.
Wir analysieren die Kopienzahl des AR bei Patienten mit Abiraterone (n = 53), 16 (30,2 %) der Patienten finden AR Gewinn7ausgestellt. In ähnlicher Weise analysierten wir die Kopie Nummer Variante für AR -gen bei Patienten mit Enzalutamid behandelt (n = 59), AR -Gewinn in 21 (36 %) der Patienten8zu finden.
Darüber hinaus wir werteten die Zuordnung zwischen AR CN und klinische Ergebnisse mit Hilfe der Kaplan-Meier-Methode und Log-Rank test und fanden eine signifikante Assoziation. Insbesondere Abiraterone Fallserien Patienten mit AR gen Gewinn ergab eine mittlere Fortschreiten überleben (PFS) von 2,8 vs. 9,5 Monaten nicht gewonnenen Fälle behandelt (p < 0,0001). Ein niedriger Gesamtüberleben (OS) wurde auch bei Patienten mit AR CN Gewinn berichtet (p < 0,0001).
In ähnlicher Weise für Enzalutamid Fallserien, fanden wir eine mediane PFS 2.4 vs. 4,0 Monate für Patienten mit AR Gewinn vs. Patienten ohne Gewinn (p = 0,0004). Darüber hinaus war die mediane OS von Patienten mit AR CN Gewinn 6.1 vs. 14,1 Monate für diejenigen ohne Gewinn (p = 0,0003). Alle AR CN Gewinn Ergebnisse aus der Real-Time PCR-Ansatz wurden bestätigt mit anderen Methoden, einschließlich digitale PCR (Abbildung 3).
Abbildung 1: Workflow und Zeitachsen. Die Methode-Workflow gliedert sich in verschiedene Schritte und Zeiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Ansatz-Sensitivität für AR CN Nachweis getestet mit 2 unterschiedlichen Pools (Beispiel 1 und Beispiel 2) der DNA von gesunden Spendern und von CRPC Patienten gewonnen für AR -gen, gemischt in verschiedenen Konzentrationen. Patienten-DNA wurden bei Prozentsätze von 0,375, 0,75, 1,5, 3, 6, 12, 25, 50 und 100, in Bezug auf Gesamt-DNA gemischt. Rote Linie: cutoff für AR CN Gewinn (1,5). Diese Zahl wurde von Salvi Et Al. modifiziert 7
Abbildung 3. AR CN Ergebnisse Vergleich zwischen Real-Time PCR (qPCR) und digitale PCR (dPCR) für mehrere Patienten (x-Achse). Schwarze Linie: cutoff für AR CN Gewinn (1,5). Diese Zahl wurde von Salvi Et Al. modifiziert 7
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Discussion
AR CN-Analyse in Serum und Plasma Probe stellt eine neue, nicht-invasive Ansatz für die Stratifizierung von Patienten mit Kastration resistenten Prostatakrebs (CRPC). Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass AR CN Ergebnisse in CRPC Patienten mit Abiraterone und Enzalutamid, vor und nach der Chemotherapie7,8,9,10vorhersagen kann.
Der Hauptvorteil unseres Ansatzes ist, dass das Protokoll sehr einfach durchzuführen, bestehend aus nur ein DNA-Isolierung-Prozess, eine Echtzeit-PCR-Analyse und einfache Daten-Interpretationen. Darüber hinaus der Test könnte schnell ausgeführten in 1 Werktag, und das Verfahren ist kostengünstig ($20 USD für jede Probe ca.). Wir haben gezeigt, dass diese Methode sehr reproduzierbar ist und die Ergebnisse im Einklang mit denen sind, die aus teurer und genaue Methoden, einschließlich digitale PCR7,8. Darüber hinaus fanden wir eine ähnliche AR gewinnen Frequenz erkannt mit gezielten NGS Ansätze auf Plasma-Proben mit Abiraterone9,10behandelt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass dieser Ansatz flexibel ist und kann für andere Krankheiten, in denen das AR -gen eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus könnten andere Ziel und Verweis Gene basierend auf die Krankheit von Interesse gewählt werden.
CN-Analyse des AR -Gens im Serum hat auch einige Einschränkungen. Erstens die DNA spektralfotometrische Quantifizierungsmethode ist oft ungenau und mit anderen, genauer fluorometrisch Ansätze ersetzt werden könnte. Eine genauere Quantifizierung könnte genauere CN Ergebnisse geben. Zweitens haben einige Studien gezeigt, dass es bessere Plasma DNA statt Serum DNA zu analysieren sein könnte. Die Menge des zirkulierenden Zelle freie DNA ist in der Regel höher im Serum als im Plasma12,13, durch die Gerinnung von weißen Blutkörperchen im Serum, darauf hindeutet, dass Serum potenziell ein schlechter Quelle für Tumor-spezifische DNA-Analysen wegen des möglichen Vorhandenseins Wildtyp DNA.
CN-Analyse des AR -Gens im Serum mit Echtzeit-PCR-Ansätzen wurde auf 112 CRPC Patienten durchgeführt, bevor sie die Behandlung mit Enzalutamid oder Abiraterone begonnen. Unsere Daten zeigten, dass AR CN auf Blut eine starke genetische Biomarker Therapieergebnis und Widerstand gegen Abiraterone und Enzalutamid ist und kann verwendet werden, um Männer zu identifizieren, die a priori von Anti -AR Therapien profitieren könnte oder Chemotherapie mit einer schnellen und kostengünstigen PCR Assay. Diese Ergebnisse unterstreichen das Dienstprogramm Blut als minimal-invasive Methode zur Vernehmung Mechanismen der therapeutischen Widerstand im frühen und fortgeschrittenen CRPC zu studieren. In Zukunft sollten Interessenten und größere Studien Patienten Schichten, durch zirkulierende AR Status im Hinblick auf die folgenden Unterschiede in klinische Ergebnisse und Behandlungserfolg.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Chiara Molinari und Filippo Martignano danken wir für die Unterstützung bei der Datenanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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