Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Summary

Vi beskriver en metode for produksjon av menneskelig antistoffer spesifikke for et antigen av interesse, fra sjeldne B celler i menneskelig blod. Generasjon av disse naturlige antistoffer er effektiv og rask antistoffer innhentet kan forskjellsbehandle meget relaterte antigener.

Abstract

Monoklonale antistoffer (mAbs) er kraftige verktøy nyttig for både grunnforskning og biomedisin. Deres høy spesifisitet er uunnværlig når antistoffer må skille mellom meget relaterte strukturer (f.eks, en vanlig protein og en mutert versjon av disse). Den nåværende måten å generere slike discriminative mAbs innebærer omfattende screening av flere Ab-produserende B celler, som er både kostbart og tidkrevende. Vi foreslår her en rask og kostnadseffektiv metode for generering av discriminative, fullt menneskelige mAbs fra menneskeblod sirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten av denne strategien er valg av spesifikke antigen bindende B celler kombinert med mot valget av alle andre celler, ved hjelp av lett tilgjengelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når bestemte B-celler er isolert, hentes cDNA (komplementære deoksyribonukleinsyre) sekvenser koding for den tilsvarende mAb ved hjelp av én celle reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) teknologi og senere uttrykt i menneskelig celler. Innen så lite som 1 måned er det mulig å produsere milligram svært discriminative menneskelige mAbs rettet mot nesten alle ønsket antigen naturlig oppdaget av B celle repertoaret.

Introduction

Metoden beskrevet her kan rask og allsidig produksjon av fullstendig menneske monoklonale antistoffer (mAbs) mot en ønsket antigen (Ag). mAbs er essensielle verktøy i mange grunnleggende forskning programmer i vitro og i vivo: flow cytometri, histology, western-blotting og blokkerer eksperimenter for eksempel. Videre brukes mAbs mer i medisin å behandle autoimmune sykdommer, kreft, og å kontrollere transplantasjon avvisning¹. For eksempel ble anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs sist brukt som immun checkpoint hemmere i kreft behandlinger².

De første mAbs ble produsert av immunglobulin (Ig)-sekresjon hybridomas Hentet fra splenic cellene i vaksineres mus eller rotter. Imidlertid hemmer sterk immunrespons mot murint eller rotte mAbs deres terapeutisk bruk i mennesker, på grunn av deres raske klarering og sannsynlig induksjon av overfølsomhet reaksjoner³. For å håndtere dette problemet, erstattet animalsk protein sekvenser av mAbs delvis av menneskelig å generere såkalte chimeric mus-menneskelige eller humanized antistoffer. Men reduserer denne strategien bare delvis immunogenisitet, mens vesentlig øke både kostnadene og på tidsskalaen for produksjon. En bedre løsning er å generere menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B celler og flere strategier for dette er tilgjengelig. En av dem er bruk av phage eller gjær. Dette innebærer å vise variabel domener en kombinasjon bibliotek av tilfeldige menneskelige Ig tunge og lys kjeder på phages eller gjær, og gjennomføre et utvalg skritt med spesifikke antigen rundt. En stor ulempe med denne strategien er at tunge og lette kjedene er tilfeldig tilknyttet, fører til en stor økning i mangfoldet av genererte antistoffer. Antistoffer innhentet er usannsynlig å korrespondere med de som vil oppstå fra en naturlig immunrespons mot en bestemt Ag. Videre er menneskelig proteinfolding og post-translasjonell modifikasjoner ikke systematisk reprodusert i prokaryoter eller i gjær. En annen menneskelig mAb produksjon metode er immortalization av naturlige menneskelige B celler, av Epstein – Barr virusinfeksjon eller uttrykk av anti-apoptotisk faktorer BCL-6 og BCL-XL⁴. Men denne metoden gjelder bare for minne B-celler og ineffektiv, som krever screening av mange mAb-produserende udødeliggjort B celler å identifisere få (om noen) mAb kloner med ønsket antigen spesifisitet. Metoden er dermed både kostbar og tidkrevende.

En ny protokoll har nylig blitt beskrevet for produksjon av menneskelig mAbs isolert enkelt B celler⁵. Det baserer seg på en optimalisert encellede reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) for forsterkning av både tung – og lett-kjeden koding segmenter fra en enkelt sortert B-celle. Dette etterfølges av kloning og uttrykk for disse segmentene i en eukaryot uttrykk system, slik at rekonstruksjon av en fullstendig menneske mAb. Denne protokollen er brukt med hell fra B-celler fra vaksinert givere. Cellene ble høstet flere uker etter vaksinering å få høyere frekvenser av B-celler som er rettet mot ønsket Ag, og dermed begrense tiden som kreves for screening⁶. Også har produsert andre fullt menneskelige mAbs HIV⁺ (humant immunsviktvirus) infisert pasienter⁷ og melanom pasienter⁸. Til tross for disse framskrittene er det fortsatt ingen prosedyre tilgjengelig som gjør isolasjon av Ag-spesifikke B celler uavhengig av deres minne fenotype eller frekvens.

Fremgangsmåten beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolasjon av mennesker sirkulerende B-cellene basert på deres BCR spesifisitet, etterfulgt av produksjonen av fullstendig menneske antigen-spesifikke mAbs i høy kapasitet og med en lav screening. Metoden er ikke begrenset til minne B-celler eller antistoff-sekresjon B celler indusert etter en immunrespons, men kan også brukes på menneskelig naiv B celle repertoaret. At det fungerer med utgangspunkt i Ag-spesifikke B celler på veldig lave frekvenser er en god indikasjon på sin effektivitet. Prinsippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) er farget med to tetramers presenterer antigen rundt, hver av dem merket med en annen fluorochrome (f.eksPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer presentere et nært beslektede antigen konjugert med en tredje fluorochrome (f.eksstrålende Violet 421 (BV421)). For å berike for antigen bindende celler, celler er deretter inkubert med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sortert i cellen separasjon kolonner. PE⁺ APC⁺ celle brøken velges, beiset med en rekke mAbs spesifikke for ulike PBMC cellen å tillate identifikasjon av B-celler og utsatt å strømme cytometri celle sortering. B-celler som PE⁺ og APC⁺, men briljante Violet^–, er isolert. Dette trinnet merker mot celler som er ikke B celler eller binder seg ikke til tetramerized antigen, men bind PE eller APC (disse cellene blir PE⁺ APC^– eller PE^– APC⁺) eller til den ikke-antigen delen av tetramers brukte (disse celler blir BV421⁺). B celler ikke svært spesifikke for av interesse er også mot merket på dette trinnet (disse cellene blir også BV421⁺). Dermed kan denne metoden rense svært spesifikke B-celler uttrykke B-celle reseptorer (BCRs) kunne skille mellom to veldig nært relaterte antigener. Én bestemt B-celler er samlet i rør og deres PCR-forsterket Ig cDNAs (utfyllende deoxyribonucleic syrer) klonet og uttrykt av en human celle linje som utskilles IgG mAbs.

Som et bevis på konseptet, denne studien beskriver effektiv generering av menneskelig mAbs, som anerkjenner et peptid presentert av en store histocompatibility kompleks klasse jeg (MHC-jeg) molekylet og kan diskriminere imellom denne peptid og andre peptider lastet på samme MHC-jeg allelet. Selv om kompleksiteten i denne Ag er viktig, kan denne måten (i) høykapasitets utvinning av Ag-spesifikke mAbs; (ii) produksjon av mAbs kunne skille mellom to strukturelt nær Ags. Denne tilnærmingen kan utvides til vaccinated eller infiserte pasienter uten endringer i protokollen, og har allerede blitt implementert i en humanized rotte systemet⁹. Derfor beskriver denne studien en allsidig og effektiv tilnærming vil generere fullt menneskelige mAbs som kan brukes i grunnforskning og immunotherapy.

Protocol

Alle menneskelige perifert blodprøver ble innhentet fra anonyme voksen givere etter samtykke, i samsvar med den lokale etikk (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, prosedyren PLER NTS-2016-08). 1. isolering av menneskelig perifert blod mononukleære celler Merk: Starte materiale kan være totale menneskelige perifert blod eller cytapheresis prøver. Bør ikke være eldre enn 8 h og supplert med antikoagulanter (f.eks, heparin). Fortynne b…

Representative Results

Starter fra PBMC fra friske blodgivere, dette prosjektet presenterer generering av menneskelig mAbs, som anerkjenner peptid Pp65495 (Pp65, fra menneskelige cytomegalovirus) presenteres av store histocompatibility kompleks klassen jeg (MHC-jeg) molekyl HLA – A * 0201 ( HLA-A2). Disse mAbs kan skille mellom Dette komplekset og komplekser representerer andre peptider lastet inn den samme MHC-jeg molekylet. PBMC var farge…

Discussion

Foreslåtte protokollen er en kraftig metode for generering av menneskelig mAbs direkte fra Ag-spesifikke B celler i blodet. Det kombinerer tre viktige aspekter: (i) bruk av en tetramer-assosiert magnetiske berikelse, som lar en ex vivo isolering av med sjeldne Ag-bindende B celler. (ii) en gating strategi som bruker tre Ag tetramers (to relevante enere og en irrelevante en) merket med tre ulike fluorochromes for å isolere, ved flowcytometri, bare B-celler uttrykke en BCR bestemt ønsket Ag; (iii) rekonstruksjo…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003