जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका
Summary
CAEBV रोगियों से NK और टी सेल क्लोन प्राप्त करने के लिए एक सरल तरीका उच्च दक्षता, परिधीय रक्त की एक छोटी राशि है, और आईएल-2 की एक कम खुराक के साथ विकसित किया गया था ।
Abstract
NK/टी सेल लाइनों लिंफोमा या lymphoproliferative सिंड्रोम के साथ रोगियों से स्थापित करने के लिए तरीकों की एक संख्या वर्णित किया गया है । इन तरीकों फीडर कोशिकाओं, शुद्ध NK या टी कोशिकाओं के रूप में ज्यादा के रूप में रक्त के 10 मिलीलीटर, या आईएल-2 की एक उच्च खुराक के साथ कार्यरत हैं । इस अध्ययन के साथ एक नई विधि प्रस्तुत करता है एक शक्तिशाली और सरल रणनीति के साथ परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं संवर्धन द्वारा NK और टी सेल लाइनों की स्थापना के साथ रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-2 (rhIL-2), और पूरे रक्त के रूप में छोटे रूप में 2 मिलीलीटर का उपयोग करता है । कोशिकाओं को दो हफ्तों में जल्दी पैदा करना और अधिक से अधिक 3 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है । इस विधि के साथ, 7 NK या टी सेल लाइनों एक उच्च सफलता दर के साथ स्थापित किया गया है । इस विधि सरल, विश्वसनीय है, और CAEBV या NK के अधिक मामलों से सेल लाइनों की स्थापना के लिए लागू/
Introduction
Epstein-बर्र वायरस (EBV) सर्वव्यापी है और न केवल बी कोशिकाओं को संक्रमित करता है, लेकिन यह भी टी और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं, जो EBV के एक नंबर-जुड़े NK का कारण बनता है/टी lymphoproliferative रोगों (LPD) और लिंफोमा/लेकिमिया, जैसे EBV-संबद्ध hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-लिंफोमा की तरह, extranodal NK/टी-सेल लिंफोमा, नाक प्रकार और आक्रामक NK सेल ल्यूकेमिया1,2,3. इनमें गंभीर जीर्ण सक्रिय EBV (SCAEBV) रोग है, जो मुख्य रूप से पूर्वी एशिया में घटना है, और जो अब EBV-संक्रमित टी या NK कोशिकाओं4,5,6के क्लोनल विस्तार की वजह से एक LPD माना जाता है, 7, लेकिन संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (IM) में स्पष्ट इम्यूनो मौजूद बिना-बुखार, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, और जिगर रोग सहित लक्षण की तरह लगातार या आवर्तक रूप, साथ ही उच्च EBV में डीएनए लोड परिधीय रक्त8,9. CAEBV के साथ रोगियों को एक गरीब रोग का निदान है10,11, और इसके रोगजनन और EBV की भूमिका स्पष्ट नहीं है । इसलिए, EBV से व्युत्पंन सेल लाइनों-संबद्ध NK/टी lymphoproliferative रोगों और लिंफोमा EBV प्रेरित NK या टी सेल प्रसार और ल्यूकेमिया की उच्च घटना के साथ अपने रिश्ते के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए सेल मॉडल के रूप में बहुत उपयोगी होते है या लिंफोमा.
तिथि करने के लिए, विभिंन तकनीकों के साथ कई सेल लाइनों की स्थापना की गई है12,13,14,15,16। एक मानव NK सेल लाइन, NK-वाईएस, NK सेल लिंफोमा/ल्यूकेमिया से स्थापित किया गया था, सह द्वारा संवर्धन फीडर के रूप में एक माउस stromal सेल लाइन के साथ, और rhIL-2 की उपस्थिति में प्रति मिलीलीटर 20U की एकाग्रता पर15। KAI3 एक और NK सेल लाइन था एक गंभीर मच्छर एलर्जी या SCAEBV ऑटोलॉगस lymphoblastoid सेल लाइन (LCL) के साथ रोगियों से स्थापित, बी कोशिकाओं EBV द्वारा परिवर्तित, फीडर कोशिकाओं के रूप में और rhIL के अलावा-2 पर 100U/एमएल16। SNK6 और SNT8-2 (700U/एमएल) के उच्च खुराक जोड़कर नाक NK/टी सेल लिंफोमा रोगियों के ट्यूमर ऊतकों से व्युत्पंन थे12। इसी तरह की तकनीक के साथ, SNK-1 सेल CAEBV रोगियों से था, PBMC से कल्चरित टी कोशिकाओं को हटाने और rhIL के 700U/एमएल जोड़ने-213,17. SNT13 और SNT15 को हटाकर CD4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं को १८ की स्थापना की गई. अब तक अन्य टी सेल और NK सेल लाइनों से EBV-NK/टी LPD रोगियों सभी इस विधि के साथ विकसित किया गया था19.
उपर्युक्त तरीकों के नुकसान फीडर कोशिकाओं के रोजगार, आईएल-2 की एक उच्च खुराक की आवश्यकता में शामिल हैं, के रूप में ज्यादा के उपयोग के रूप में 10 मिलीलीटर पूरे रक्त, या NK/टी कोशिकाओं है, जो बहुत चुनौतीपूर्ण है के कारण क्लिनिक में की शुद्धि कोशिका के किस प्रकार है कि EBV अव्यक्त रूप से संस्कृति के लिए शुरुआत से पहले संक्रमित की पुष्टि की आवश्यकता । के रूप में CAEBV मुख्य रूप से एशिया में बच्चों में होता है, 10 मिलीलीटर रक्त सभी क्षेत्रों में प्राप्त करने के लिए आसान नहीं है । इस अध्ययन में, हम एक उच्च सफलता दर के साथ एक नई सरल विधि विकसित करने के लिए NK और/या CAEBV रोगियों से संवर्धन PBMC द्वारा टी सेल लाइनों की एक कम खुराक का उपयोग कर rhIL2 और फीडर कोशिकाओं के बिना पूरे खून की 2 मिलीलीटर की मात्रा । इस विधि के परिणाम अपनी उच्च दक्षता और समय की बचत साबित कर दिया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, CAEBV रोगियों के पूरे रक्त से NK/टी सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक उपंयास तकनीक विकसित किया गया है । मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में, इस विधि का प्रमुख लाभ अपनी सादगी और रक्त की केवल एक छोटी म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीनी विज्ञान अकादमी के प्रमुख परियोजनाओं (KFZD-SW-205), सामरिक जैविक संसाधन प्रौद्योगिकी के चीनी विज्ञान अकादमी के समर्थन प्रणाली (CZBZX-1 और ZSSB-004) द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा चीन ( ८१४०१६४०) और शंघाई प्राकृतिक विज्ञान कोष (14ZR1434800) ।
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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