Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK
Summary
Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.
Abstract
Vários métodos têm sido descritos para estabelecer linhas de células NK/T de pacientes com síndrome de linfoma ou linfoproliferativa. Estes métodos empregados alimentador células, purificado de células NK ou T com tanto quanto 10 mL de sangue ou uma dose elevada de Il-2. Este estudo apresenta um novo método com uma estratégia simples e poderosa para estabelecer linhas NK e células T pelo cultivo do periférico sangue células mononucleares (PBMC) com a adição de Il-2 humana recombinante (rhIL-2) e usa tão pouco quanto 2 mL de sangue total. As células podem proliferar rapidamente em duas semanas e ser mantidas por mais de 3 meses. Com este método, 7 linhas de NK, ou células T se estabeleceram com uma elevada taxa de sucesso. Este método é simples, confiáveis e aplicáveis ao estabelecimento de linhagens celulares de mais casos de linfoma de células CAEBV ou NK/T.
Introduction
Vírus de Epstein – Barr (EBV) é onipresente e infecta não apenas as células B, mas também T e as células killer naturais (NK), que faz com que um número de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, tais como hemofagocítica EBV-associados hemophagocytosis, hydroa vaciniforme, como linfoma, linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal e NK agressiva células leucemia1,2,3. Entre estes é crônica ativa EBV (SCAEBV) doença grave, que é incidente principalmente no leste da Ásia, e que é agora considerado um LPD causada pela expansão clonal de infectadas por EBV T ou NK células4,5,6, 7, mas sem a aparente da imunodeficiência presentes na mononucleose infecciosa (IM)-como sintomas que incluem febre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia e disfunção hepática persistentemente ou periódica, bem como alta EBV-DNA carregar na sangue periférico8,9. Pacientes com CAEBV têm um prognóstico pobre10,11e sua patogênese e desconhece-se o papel do EBV. Portanto, cela linhas derivadas de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T e linfomas são muito úteis como modelos de celular para esclarecer o mecanismo de EBV induzida proliferação NK, ou células T e a sua relação com alta incidência de leucemia ou linfoma.
Até à data, foram estabelecidas várias linhagens celulares com diferentes técnicas12,13,14,15,16. Uma linhagem de células NK humana, NK-YS, estabeleceu-se de leucemia/linfoma de células NK, por co cultivo com uma linhagem de células do estroma do rato como alimentador e na presença de rhIL-2 em uma concentração de 20U por mL15. KAI3 era uma outra linha de célula NK estabelecida de pacientes com alergia severa mosquito ou SCAEBV com linha de células autólogas lymphoblastoid (LCL), células B, transformadas por EBV, como células de alimentador e adição de rhIL-2 em 100U/mL16. SNK6 e SNT8 foram derivados de tecidos de tumor da nasais pacientes de linfoma de células NK/T pela adição de altas doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Com uma técnica semelhante, a célula de SNK-1 foi de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC, removendo as células T e adicionando 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 foram estabelecidas através da remoção de CD4 + e CD8 + células18. Até agora, outras linhas de celular de células T e NK de pacientes EBV-NK/T LPD foram todos desenvolvidas com este método de19.
As desvantagens dos métodos existentes acima mencionados incluem o emprego de células do alimentador, a exigência de uma alta dose de IL-2, a utilização de sangue tanto quanto 10 mL ou a purificação de células NK/T, que é muito desafiador na clínica devido a a necessidade de verificar quais os tipos de célula que EBV Latentemente infecta antes de começar a cultura. Como CAEBV ocorre principalmente em crianças na Ásia, 10 mL sangue não é fácil de adquirir em todas as regiões. Neste estudo, nós desenvolvemos um novo método simples com uma elevada taxa de sucesso para estabelecer linhas NK e/ou células T pelo cultivo PBMC de pacientes CAEBV, usando uma dose baixa de rhIL2 e um volume de 2 mL de sangue total sem células de alimentador. Os resultados deste método provaram sua eficiência elevada e economia de tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, desenvolveu uma nova técnica para o estabelecimento de linhas de células NK/T do sangue inteiro de pacientes CAEBV. Comparado com os métodos existentes, a grande vantagem deste método é sua simplicidade e sua exigência de apenas um pequeno volume de sangue, enquanto que apresenta uma elevada taxa de sucesso e boas condições de viabilidade celular. Além disso, as linhas de células NK/T podem ser estabelecidas por PBMC de cultivo sem determinar os tipos de célula, o EBV Latentemente infectada co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela projetos chave da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), estratégico biológicos recursos tecnologia sistema de suporte de chinês Academia de Ciências (CZBZX-1 e ZSSB-004) e por doações de (Fundação Nacional de ciência da China 81401640) e o fundo de ciências naturais (14ZR1434800) de Shanghai.
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
